一、编号：JS0606
二、标题：免疫组织化学操作规程
三、关键词：免疫组织化学 操作规程
四、目的：免疫组织化学主要进行蛋白物质（抗原）的定性、定位检测。
五、背景知识
20世纪30年代，随着生物化学的发展和电子显微镜技术的应用，组织化学迎来了复兴时代。自从E. Takamatsu（高松英雄）和G. Gomori 1939年同时证明了硷性磷酸酶的组织化学方法，以后的30年间，酶组织化学得到了飞速发展，高松证明了磷酰胺酶、ATP酶；Gomori设计了酸性磷酸酶、脂酶、酯酶等组织化学证明法。
此间，金属盐法，硫化钴法，偶氮色素法，偶氮色素四唑盐法（tetrazolium salts method）以及磷酸化酶组织化学证明法等相继问世。特别是H. Scheldon和D. Brandes等人把电镜与酶组织化学结合起来，以金属沉淀法观察了酸性磷酸酶和硷性磷酸酶，奠定了电镜酶组织化学（electron microscope enzyme histochemistry）基础。后来A. M. Seligman(1967)提出锇黑化法（Osmification method）进一步阐述了电镜组织化学的基本原理和反应过程。
1950年A. H. Coons等人提出了荧光抗体法，从而把免疫学引入组织化学实验中，后来P. K. Nakane，S. Avrameas和L. A. Sternberger等人以辣根过氧化物酶为标记物对酶进行观察，创立了酶标抗体法，从而为组织化学开辟了新途径。
随着分子生物学的发展，1969年人们把分子杂交技术应用到组织切片和细胞标本上，开始探索原位杂交技术，经过30年不断应用、完善和发展，特别是探针制备与标记物两大关键技术的突破，目前原位杂交技术已广泛应用于遗传学、病毒学、神经内分泌学、病理学、免疫学和发育生物学等各个领域，显示出巨大的应用潜力。
现代组织化学已经渗透和应用于生命科学的许多学科，经过近几十年的发展，产生了许多分支，如核酸与核蛋白、蛋白质与氨基酸、脂类与脂蛋白、碳水化合物与粘蛋白及粘多糖、无机物组织化学、酶组织化学电镜组织化学、荧光组织化学、免疫组织化学、同工酶组织化学、定量组织化学、原位杂交组织化学和放射自显影技术等。总之，现代组织化学的概念已经远远超过了原有范围，无论从理论、内容、技术手段、研究范围都比过去更广泛、更深入。
六、原理：基于利用放射性核素和其他标记物（荧光素、酶、重金属离子等）作为示踪剂，通过免疫亲和（抗原-抗体特异性结合）和核酸杂交（碱基配对特异性连接）途径，在组织切片或细胞涂片上，原位显示生物大分子的动态变化的一门染色技术。
七、仪器设备和材料
1、仪器设备
18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉，水浴锅。
2、试剂
1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO44.3mmol/L，KH2PO41.4mmol/L。
2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。
3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA•2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0，加水至1000ml。
4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0，加水至1000ml。
5）酶消化液： ①0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8)配制。②0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
7）封裱剂：①甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；②甘油和TBS(或PBS)配制。
8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。
八、操作步骤
1、脱蜡和水化
脱蜡前，应将组织切片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
1）组织切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；
2）无水乙醇中浸泡5分钟；
3）95%乙醇中浸泡5分钟；
4）70%乙醇中浸泡5分钟。
2、抗原修复
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片。
1）抗原热修复
⑴高压热修复：在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
⑵煮沸热修复：电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织切片加热10~15分钟。
⑶微波热修复：在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织切片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
2）酶消化方法：常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶37℃消化时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，常用于Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等抗原。
3、免疫组织化学染色完整步骤
SP法
1）脱蜡、水化；
2）PBS洗2～3次各5分钟；
3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；
4）PBS洗2～3次各5分钟；
5）抗原修复；
6）PBS洗2～3次各5分钟；
7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟后甩去多余液体。
8）滴加I抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
10）PBS洗3次各5分钟；
11）滴加II抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；
12）II抗中可加入0.05%的tween-20。
13）PBS洗3次各5分钟；
14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；
15）PBS或自来水冲洗10分钟；
16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；
17）自来水冲洗10～15分钟；
18）脱水、透明、封片、镜检。
SABC法
1）脱蜡、水化。
2）PBS洗两次各5分钟。
3）用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。
4）抗原修复。
5）PBS洗5分钟。
6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟后甩去多余液体。
7）滴加I抗，室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。
8）PBS洗3次每次2分钟。
9）滴加生物素化二抗，20～37℃20分钟。
10）PBC洗3次每次2分钟。
11）滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。
12）PBS洗4次每次5分钟。
13）DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。
14）蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。
15）脱水、透明、封片、镜检。
九、注意事项
1、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。
2、组织脱水必须彻底干净。
3、切片必须完整、均匀、平展、无皱折。
4、切片的附贴必须牢固，必须使用合适的粘贴剂。新的载玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜，然后取出，经自来水彻底冲洗后，浸入酒精中达2小时以上，取出擦干备用或烘干也可。然后再将载玻片浸入3－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy- silane）的稀释液（1：50用丙酮或无水乙醇稀释都可以）中硅化10分钟，后经无水乙醇洗2次，烘干即可使用。
5、切片必须烘烤附贴牢固，既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片，又不至于破坏抗原，切片在60℃的恒温干燥箱中烘烤2-5小时最为合适。
6、切片脱蜡必须干净，否则将会影响免疫组化染色的最后结果。
7、必须彻底抑制内源性过氧化物酶的活性，才能降低背景的染色。H2O2甲醇较适合于大多数的情况，因为除了H2O2外，甲醇对各种酶，都有钝化的作用，因此H2O2甲醇的双重作用效果较好。
8、抗体的加入须注意的问题：①当PBS冲洗完毕后，在加入抗体，如一抗，二抗或三抗。必须将存留于切片上的多余的PBS摔干，但不能让切片干涸，切片干涸，往往可产生非特异性染色，切片上PBS存留过多，将会稀释加入的抗体，影响加入抗体的浓度，同时也将影响最后的结果，如假阴性等。②加入的抗体以一滴为佳。当擦干组织块周边多余的PBS后，切片保持着一定的湿润度，此时加入另外的抗体为最佳时候，滴入抗体以一滴50μl为好，加入后，轻微地摇匀地覆盖于切片上，使最后的结果稳定均衡，不至于有的地方有反应，有的地方无反应。③切片没擦好将会影响加入抗体的质量。当加入抗体后，它可缩于切片的一边，此时你为了使加入的抗体能够完全地覆盖整个切片，便会使劲地加入抗体，此时的结果是，抗体依然滑向一边，或者完全露出，这不光没达到目的，还浪费抗体，正确的做法就是彻底地用PBS冲洗，摔干切片擦干切片周边的PBS，再滴入一滴抗体轻轻摇匀即可。
