一、编号：JS0701
二、标题：大鼠主动脉血管平滑肌细胞体外培养操作规程
三、关键词：大鼠 主动脉 血管平滑肌 细胞培养 操作规程
四、目的：探索大鼠主动脉血管平滑肌细胞体外培养的操作规范化
五、背景知识：动脉粥样硬化的发生源于循环因子和血管壁各种细胞的综合相互作用，包括内皮细胞、淋巴细胞、单核细胞和平滑肌细胞（SMCs）。新近的一些综述强调了动脉粥样硬化发生和早期进展过程中活化的内皮细胞和炎症细胞募集反应的作用。但尸检、体内外研究资料显示，SMCs对动脉粥样硬化的发生具有重要作用。SMCs是血管壁中产生细胞外基质的主要细胞，在动脉粥样硬化刺激因子的作用下，它可以改变基质蛋白的类型，而基质蛋白又会影响脂质斑块及粘附其上的细胞增殖指数。SMCs对于其它细胞也有作用，例如巨噬细胞，SMCs可以表达各种有利脂类吸收的受体并形成泡沫状细胞，参与脂斑的早期富集。
六、原理：通过组织细胞培养的方法，在体外单独进行血管平滑肌细胞的培养，通过加入血管紧张素-II或氧化低密度脂蛋白，平滑肌细胞体外可模拟粥样硬化时的表现，进而快速、微量地研究药物对其作用。
七、仪器和材料
1、实验动物：健康Wistar大鼠，体重150±30g，由湖北省预防医学院实验动物中心提供，SPF级。
2、主要试剂及耗材：DMEM培养液、胰蛋白酶(Sigma公司)；优质胎牛血清(武汉三利生物技术有限公司)；青霉素、链霉素(Sigma公司)；无钙镁Hank’s (D-Hank’s液)、兔抗大鼠α-actin单克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；即用型SABC试剂盒（武汉博士德公司）。培养器皿(武汉三利生物技术有限公司)：25ml塑料培养瓶、培养面积25cm2、直径3.5cm培养皿。
3、主要仪器设备：恒温CO2培养箱（SHELDON公司）；倒置相差显微镜(CK2型，OLYMPUS公司)；电子分析天平（AX205，Mettler Toledo）；电动移液器(Hamburg)。
八、操作步骤
1、主要溶液配制
无血清培养基：DMEM培养基（含青霉素G钠100U/ml、链霉素100U/ml，pH 7.2）。
完全培养液：DMEM培养基（含20%胎牛血清、青霉素G钠100U/ml、链霉素100U/ml，pH7.2）。
0.01MPBS：NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O1.79g，KH2PO40.2g，用蒸馏水定容至1000ml,调节pH值至7.2，高压灭菌，4℃保存备用
D-Hank's液：KCl0.4g，KH2PO40.06g，NaCl8.0g，Na2HCO30.35g，酚红0.02g，三蒸水定容至1000ml，高压灭菌，4℃保存备用。
0.25%胰蛋白酶消化液：用PBS液配制，针式过滤器过滤除菌，4℃保存。
0.01%多聚赖氨酸溶液：双蒸水配制，针式过滤器过滤除菌，4℃保存。
4%多聚甲醛：多聚甲醛40g，用0.01MPBS定容至1000ml，加一粒NaOH，60℃助溶，边搅拌边加热至透明。
2、大鼠主动脉血管平滑肌细胞的分离及培养
将大鼠用10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔麻醉后全身浸入75%乙醇中消毒2min，移入托盘，置于桌面式超净台内。T型剪开胸腹部皮肤及胸骨，暴露胸腹腔。将大鼠左肺向右侧翻转，完整剪取胸主动脉，立即移入D-Hank's液清洗血污数次。移入超净工作台内，在盛D-Hank's的培养皿中完整剥除血管外膜，纵向剖开血管，D-Hank's漂洗两次后将血管内膜面向上平铺于平皿，用刀片轻轻刮擦内膜表面1～2次，除去内皮细胞。减去两端钳夹过的组织，再用D-Hank's液漂洗2次，用弯头小剪刀剪成1 mm3的小块，用吸管移入培养瓶内，以0.5 cm间距使组织块均匀贴于培养瓶底部。将培养瓶底面向上，放入37℃、5%CO2培养箱中静置4～6h后，加入含20% FCS的DMEM培养液，使组织块浸入培养液中，细胞长出后换液，以后每2～3天换液1次。
3、血管平滑肌细胞的传代
待组织贴块在培养瓶内铺满单层后，弃原培养基，用PBS液轻洗1次，加0.25%胰蛋白酶1ml，37℃消化2～3min，待单层细胞松动浮起时，加入完全培养液终止消化，用吸管轻轻吹打数次，使细胞完全分散。在倒置显微镜下计数细胞，用稀释配成106/ml的细胞悬液，接种于培养瓶和培养板中，37℃、5%CO2下培养。
4、血管平滑肌细胞的鉴定
(1)形态学：用倒置相差显微镜常规观察细胞生长形态及生长规律。
在贴壁5天后可见细胞从组织块边缘爬出，多呈梭形或长梭形，胞核为卵圆形，有一个或多个核仁，胞浆丰富，细胞间常有突起相连。第1代培养细胞胞体较小，胞质折光性强。传代后平滑肌细胞突起增多，胞质伸展，较多分支状突起，细胞平行排列成束，部分区域细胞多层重叠，部分区域呈单层，呈现平滑肌细胞典型的“峰”、“谷”状生长。
(2)抗α-actin的免疫组织化学染色：①制备细胞爬片：第3代的血管平滑肌细胞长满培养瓶约80%时，PBS清洗，0.25%胰蛋白酶1ml消化2～3min，用吸管轻柔吹打，将细胞分散，接种于6孔培养板中经多聚赖氨酸预处理的盖玻片上，静置4h后加入培养液培养，细胞长满盖玻片后，4%多聚甲醛固定，α-actin免疫组化染色，血管平滑肌细胞呈阳性表达。
九、注意事项
1、培养液需采用新鲜三蒸水配制。培养液配制后4℃放置超过2周，需添加谷氨酰胺。
2、溶液pH值：绝大多数细胞耐酸不耐碱，血管平滑肌细胞尤其如此。因此要求培养液pH值稳定于7.2左右，若pH>7.4，则血管平滑肌细胞不易成活。在配制培养液时加入15～25mmol/L缓冲盐可保持pH稳定。
3、选择好的血清是血管平滑肌细胞培养中至关重要的一环。
4、原代培养首次传代时宜用稍高的细胞接种密度和较浓度高胎牛血清(15～20%)培养基易获得较好活力的血管平滑肌细胞。
5、选择血管供体时，应注意动物的年龄。年幼者原代培养成活率高，但体重小于150g时，血管组织太少，实际操作困难，故一般选用体重150～180g大鼠。组织块的大小、摆放密度及反转培养时间也需注意，组织块不应剪切过小，1mm3最合适，否则组织块损伤大，且在反转培养过程中，水分易丧失，导致原代培养失败。组织块间距0.5cm时即能保证细胞从组织块游出后有足够的生长空间又能保持局部细胞密度的均匀，从而获得尽量多的原代细胞。适当减少反转培养时间有利于组织块存活，而较长的反转培养时间则使组织块牢固贴壁不易被冲起。
6、血管平滑肌细胞纯化问题：由于主动脉中膜除血管平滑肌细胞外没有其它细胞混杂，因此易获得较纯血管平滑肌细胞，实验过程中应注意仔细剥离血管外膜和内膜并反复冲洗。另外，即使在培养早期有内皮细胞混杂，随着细胞传代和血管平滑肌细胞旺盛增生，最终内皮细胞将消失。
