一、编号：JS0610

二、标题：肿瘤细胞系细胞培养操作规范

三、关键词：肿瘤 细胞培养 操作规范

四、目的：规范肿瘤细胞系细胞培养的操作

五、背景知识：细胞培养技术是体外研究生理环境的重要技术手段，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要的基础生物实验技术。肿瘤细胞在体外的培养对于抗肿瘤药物的研究具有很大的应用价值。

六、原理：细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。

细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增3～6次。细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。

七、仪器设备和材料：干粉型培养基（GIBCO，1L），胰蛋白酶（AMRESCO,10g），青霉素（武汉凌飞科技有限公司），链霉素（武汉凌飞科技有限公司），HEPE’s（武汉凌飞科技有限公司），小牛血清（杭州四季清公司）。电子天平（AX205，梅特勒－托利多），PH计（pHS-3C，上海雷磁），磁力搅拌器（CL-4B，郑州长城科工贸有限公司）。

八、操作步骤

1、传代前准备

(1)预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。

(2)用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。

(3)正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。

(4)点燃酒精灯：注意火焰不能太小。

(5)准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。

(6) 取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。

(7) 从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。

(8) 打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。

2、胰蛋白酶消化

(1) 加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。

(2) 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。

(3) 吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。

3、吹打分散细胞

(1) 吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。

(2) 吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。

(3) 平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。

(4) 弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。

4、分装稀释细胞

(1) 分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。

(2) 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。

5、实验结果及评价

传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个(＋)，占50％为(＋＋)，占75％时为(＋＋＋)。

九、注意事项

1、严格的无菌操作

2、适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。