一、编号：YQ0608
二、标题：Waters高效液相色谱仪操作规程
三、关键词：高效液相色谱仪 操作规程
四、目的：规范高效液相色谱仪的操作
五、背景知识：色谱法在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。后来不仅用于分离有色物质，还用于分离无色物质，并出现了种类繁多的各种色谱法。许多气体、液体和固体样品都能找到合适的色谱法进行分离和分析。目前色谱法已广泛应用于许多领域，成为十分重要的分离分析手段。但不管属于哪一类色谱法，其共同的基本特点是具备两个相：不动的一相，称为固定相；另一相是携带样品流过固定相的流动体，称为流动相。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。
六、原理：高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、工作站（或记录仪）等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内,由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式存储或打印出来。液相色谱法发展的初始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromato- graphy，HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法（High Pressure Liquid Chromatography，HPLC）。
七、仪器和材料：Waters高效液相色谱仪及相应色谱柱，甲醇或乙腈，对照品，样品。
八、操作步骤
1、打开总电源，打开稳压器电源。
2、将waters 515泵进液管放入装有已脱气的流动相中，打开泵电源，如进液管内有气泡，用注射器顶紧排液孔后，逆时针方向转动排液阀，利用注射器抽液时的负压带动气泡进入注射器，直到进液管内无气泡为止，顺时针方向拧紧排液阀。按下泵面板EDIT按钮，利用▼、▲和EDIT按钮调节以所需的流量，依次按下MENU、RUN按钮，开始用流动相冲柱。
3、打开检测器电源，5分钟后打开计算机，双击桌面上Millennium32图标，进入工作站，单击工作站主界面Project后▼按钮，从下拉菜单中选中所需的项目。
4、右键单击主界面Run Samples菜单，选中所需的系统，进入Run Samples界面。
5、单击Instrument Method下的▼按钮，选中所需的方法，再单击Monitor按钮，进行监测。待基线平稳后，单击红色的Abort按钮，停止监测。
6、取出进样器的保护针，保证进样器旋钮在LOAD状态下，用微量进样针精确吸入样品或供试品，进针后缓缓推入进样器。在Run Samples界面下输入相应的数据名，单击Inject按钮，待状态栏出现waiting后快速顺时针方向旋转进样器旋钮至INJECT状态。
7、数据采集完，至状态栏出现Complete后，快速逆时针旋转进样器旋钮至LOAD状态，取出进样针，继续下一个样品。在采样过程中，状态栏显示Running状态时如需退出采样状态，则单击Abort按钮。
8、完成全天采集数据工作后，用纯甲醇冲洗进样针5次，旋纽处于LOAD状态时放上进样器的保护针，然后冲洗进样器5次。壮关闭Millennium32系统主界面以外的所有窗口，单击主界面上Logout按钮，再单击主界面右上角关闭按钮，然后再退出Windows操作系统。
9、按下泵面板STOP键，等泵显示屏上显示的压力小于50psi后，关闭515泵电源。
10、关闭稳压器电源，关闭总电源。
九、注意事项
1、流动相必须用HPLC级试剂，使用前过滤除去其中颗粒性杂质和其他物质（使用0.45um或更细的膜过滤）。
2、流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应恢复到室温后使用。
3、不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。
4、使用缓冲液时，做完样品后立即用去离子水冲洗管路及柱子1小时，然后用甲醇（或甲醇水溶液）冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也用去离子水冲洗20分钟以上。
5、长时间不用仪器，应将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应用有机相（甲醇等），因纯水易长霉。
6、每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样口。
7、C18柱决不能进蛋白样品、血样和生物样品。
8、堵塞导致压力太大，按预柱——混合器中的过滤器——管路过滤器——单向阀检查并清洗。清洗方法：⑴以异丙醇作溶剂冲洗；⑵放在异丙醇中间用超声波清洗；⑶用10%稀硝酸洗。
9、气泡易致使压力不稳，重现性差，所以在使用中要尽量避免产生气泡。
10、如果进液管内不进液体，要使用注射器吸液，通常在输液前要进行流动相的清洗。
11、注意柱子pH范围，不得注射强碱、强酸，特别碱液。
12、更换流动相时应先将吸滤头部分放入烧杯中边震荡边清洗，然后插入新的流动相中，更换无互溶性的流动相是要用异丙醇过度一下。
13、分析结束后，应继续用流动相清洗进样阀和检测器约10～20min。
