实验方法原理

原位PCR是原位杂交细胞定位和PCR的高灵敏度相结合的技术，使得靶基因检测有了极大的改进。此技术是在细胞（爬片、甩片或涂片）或组织（石蜡、冰冻切片）上直接对靶基因片段进行扩增，通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。

试剂

福尔马林、二甲苯、PBS、Tris-HCl、Triton-X100、蛋白酶K、PCR反应缓冲液、Tag酶、Tween-20、指甲油、无水乙醇、苏木素染色液、NP-40、NaCl、MgCl2、BSA、DAB、过氧化氢、盐酸酒精液

仪器耗材

玻片、湿盒、滤纸、显微镜

实验步骤

一、组织切片和细胞样品的制备

1. 试剂与配置

10%福尔马林；二甲苯；PBS。

2. 操作方法

（1）用10%福尔马林固定组织8~15 h，石蜡包埋，切片（4 μm），将切片置于新鲜的二甲苯中处理5 min，放入无水乙醇中浸泡5 min，取出，空气干燥；

（2） 对于培养细胞，可直接制备爬片，也可有PBS洗细胞一次，加10%福尔马林静置过夜，用橡胶刮下细胞；用PBS洗细胞两次，2 000 rpm×3 min，用5 ml PBS重悬细胞，即可用甩片机甩片或直接吸50 μl点在载玻片上。

二、切片预处理（蛋白酶消化）

1. 试剂与配置

0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.4)

缓冲液A：0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.4)，0.3% Tween-20，0.5% NP-40

蛋白酶K：20-50μ g/ml，溶于TE中

2. 操作方法

（1）干燥后的切片置于0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.4)中，室温孵育5 min；

（2）浸入缓冲液A中，室温孵育10 min；

（3） 滴加20 μl蛋白酶K液于标本上，在湿盒中37℃孵育20 min；

（4）在室温下，用0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.4)漂洗两次，每次5m in。

三、原位扩增（以标记生物素为例）

1. 试剂与配置

PCR反应缓冲液：两种引物各100pmol，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μmol， Bio-dUTP 50mol，1×PCR缓冲液；

Tag酶：5U/μl

缓冲液B：0.01mol/L PBS，0.1% Triton-X100

指甲油（市售）

无水乙醇

2. 操作方法

（1）切片用1×PCR缓冲液平衡3次，每次5 min；

（2） 用滤纸吸去切片上多余的液体，置60℃，每片加入30 μl PCR反应缓冲液，5 U Tag酶，用盖玻片封片，四周封以指甲油，防止蒸发；

（3） 94℃变性5 min，按下列条件（94℃×2 min，55℃×2 min，72℃×3 min）循环20~25次后，72℃延伸5 min；

（4）玻片浸入无水乙醇中10 min，以软化指甲油；

（5） 用刀片撬开盖玻片并除去；

（6） 用缓冲液B漂洗两次，每次3 min；

（7）用无水乙醇固定5 min，并吹干。

四、检测（以ABC法为例）

1. 试剂与配置

缓冲液C：0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.5)，0.1 mol/LNaCl，2 mmol/L MgCl2， 0.5% Triton-X100

封闭液：3%BSA（溶于缓冲液C中）

显色液：0.05%DAB，溶于0.05 mol/L Tris-HCl (pH7.4)，临用前每10 ml加30%过氧化氢50 μl。

1%盐酸酒精液

苏木素染色液

2. 操作方法

（1） 用30 μl 3%BSA滴加在玻片上，封闭1 h；

（2）用缓冲液C简洗1 min，每片滴加ABC复合物20～30 μl，室温放置40 min；

（3）缓冲液B室温漂洗3次，每次15 min；

（4） 滴加显色液于玻片上，镜下观察控制显色时间（一般7～14 min）；

（5）流水洗片，浸入苏木素液中复染30 s，1%盐酸酒精分化（提抽2次）；

（6） 常规脱水、透明、封片，镜下观察。