利用碘克沙醇梯度溶液分离动物细胞核

作者: 时间:2014-05-19 点击数:

主要试剂

1. OptiPrepTM(600g碘克沙醇,ρ=1.32g/ml);

2. OptiPrepTM稀释剂(OptiPrepTM diluent,OD):150mmol/L KCl、30mmol/L MgCl2、120mmol/L三甲基甘氨酸-KOH,pH7.8;

3. 匀浆介质(HM):0.25mol/L蔗糖、25mmol/L KCl、5mmol/L MgCl2、20mmol/L三甲基甘氨酸-KOH,pH7.8;按要求向OptiPrepTM稀释剂和匀浆介质中加入蛋白酶抑制剂。

主要设备

1. 高转矩桥式电动机(半导体开关控制);

2. Potter-Elvehjem匀浆器,20—40ml,孔隙约0.07mm;

3. 高速离心机,带可容纳15—50ml离心管的吊桶式转子;

4. 注射器,带金属套管针(内径约0.8mm);

5. 尼龙滤网。

实验材料

新鲜的小鼠肝脏。

实验步骤

1. 制备500g/L碘克沙醇工作液:每5倍体积OptiPrepTM用1倍体积的OptiPrepTM稀释剂来稀释;

2. 梯度溶液:用匀浆介质(分别为6倍体积加4倍体积和7倍体积加3倍体积)来稀释500g/L碘克沙醇工作液以制备300g/L和350g/L的两种碘克沙醇梯度溶液。保持于冰上。

3. 切除肝脏并用剪刀剪切成微小碎块;

4. 将大约一半肝脏转移到Potter-Elvehjem匀浆器的20ml匀浆介质中,并用研杵研磨约8次,在约500r/min转速下旋转以破碎组织;

5. 对另一半肝脏切碎物重复以上操作;

6. 用尼龙滤网过滤;

7. 通过与等体积的500g/L碘克沙醇工作液混合将匀浆液调整到250g/L碘克沙醇;

8. 将10—15ml匀浆液转移到50ml管中,从300g/L和350g/L的碘克沙醇梯度溶液中各取10ml加到匀浆液之下;

9. 在100000g下离心20min;

10. 细胞核在300g/L和350g/L碘克沙醇界面上成带,用注射器和金属套管针吸取细胞核;

11. 用2倍体积的匀浆介质稀释悬液,在2000g下离心10min沉淀细胞核。

注意事项

所有操作在0—4℃下进行。

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