一、编号：YQ0606
二、标题：FACSCalibur流式细胞仪操作规程
三、关键词：流式细胞仪 操作规程
四、目的：保证流式细胞仪的安全及有效操作
五、背景知识：流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。
六、原理
待测细胞染色后制成单细胞悬液，用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过A/D转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。
细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。
七、仪器和材料：FACSCalibur流式细胞仪，染色好的单细胞悬液
八、操作步骤
(一)开机程序
1．检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。
2．打开储液箱，倒掉废液,并在废液桶中加入400ml漂白水原液。打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFlow），合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。
3．将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY，预热5－10分钟。排出过滤器内的气泡。
4．如果需要打印，打开打印机电源。
5．打开电脑，等待屏幕显示出标准的苹果标志。
6．执行仪器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的气泡。
7．分析样品时，先用FACAFlow或PBS进行HIGH RUN约2分钟。
做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。
(二)预设获取模式文件(Acquisition Template Files)
1．从苹果标志中选择CELLQuest建一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。
2．选取屏幕绘图工具中的Dot plot，绘出一个或多个Dot Plots（散点图）。从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源，并确定适当的x轴和y轴参数。
3．选取屏幕左列绘图工具中的Histogram，同上法可绘出Histogram（直方图）。
4．将此视窗命名后储存于FACStation G3BD Applications CELLQuest Folder EXP文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。
(三)用CELLQuest进行仪器的设定和调整
1．从苹果画面中选取CELLQuest，进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件。
2．从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer进行电脑和仪器的连机。将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。
3．从Cytometer指令栏中，开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四个对话框，并将它们移至屏幕右方，以便获取数据时随时调整获取条件。
4．在Detectors/Amps对话框中，先为每个参数选择适当的倍增模式(Amplifier mode)：线性模式Lin或对数模式Log。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时，FSC和SSC多以线性模式Lin测量，且DDM Param选择FL2，而FL1, FL2与FL3则以对数模式Log测量；分析细胞DNA含量时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3皆以Lin进行测量，且DDM Param选择FL2；分析血小板表型时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3等均以Log进行测量。
5．放上待检测的样品，将流式细胞仪设定于RUN，流速可在HIGH、MED或LOW上。
6．在Acquisiton Control对话框中，选取Acquire，开始获取细胞。在以下的仪器调整过程中随时选取Pause，Restart以观察调整效果。未完全调整好之前不要去掉SETUP前的“√”。
7．在Detectors/Amps对话框中，调整FSC和SSC探测器中的信号倍增度：PMT voltages（粗调）与Amp Gains（细调），使样品信号出现在FSC-SSC点图内，且细胞亚群合理分布。
8．在Threshold对话框中选择适当的参数设定Threshold，并调整Threshold的高低，以减少噪音信号（细胞碎片）。一般做细胞表型时用FSC－H而做DNA周期分析时用FL2-H。Threshold并不影响检测器对信号的获取，但可改善画面质量。
9．从屏幕左列绘图工具中选取Region（区域），并在靶细胞周围设定区域线，即通常所说的设门。圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易。
10．Detectors/Amps对话框中，调整荧光检测器（FL1, FL2, FL3, FL4等）的倍增程度。根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群，使之分布在正确的区域内。
11．在Compensation对话框中，根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色（或多色）荧光染色所需的荧光补偿。比如应该为FL1+ FL2-的细胞群却分布在FL1＋FL2＋区域内，则需调大FL2－？％FL1中的“？”，并从FL1-FL2点图中观察新的调整是否恰当
12．在Status对话框中可见：Laser Power:正常值—Run/Ready为14.7mW，Standby为5mW；Laser current:正常值为6Amps左右。
13．调整好的仪器设定可在Instrument Settings对话框中储存，下次进行相同实验时可调出使用，届时只需微调即可。
(四)通过预设的获取模式文件进行样品分析
1．从苹果标志中选择CELLQUEST，新视窗出现后从File指令栏中选择Open，打开预设的获取模式文件。
2．从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer进行电脑和仪器的连机。将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。
3．从Cytometer指令栏中选取Instrument Settings，在其对话框中选择Open以调出以前存储的相同实验的仪器设定，按Set确定。
4．在Acquire指令栏中，选择Acquisition&Storage决定储存的细胞数，参数，信号道数。其中Resolution在做细胞表面标志时选择256，做DNA时选择1024。Parameter Saved…则根据不同的检测对象选择不同的参数。
5．在Acquire指令栏中，选择Parameter Description，以决定文件存储位置(folder)，文件名称(file)，样品代号以及各种参数的标记(panel)，即安排tube1，2，3…的检测参数。
6．在Cytometer指令栏中，选择Counters，将此对话框移至合适位置，以便于随时观察events计数。
7．将样品试管放至检测区，在Acquire Control对话框中选取Acquire以启动样品分析测定。
8．微调仪器设定，待细胞群分布合适后选择Acquire Control对话框中Pause, Abort,去除Setup前的“√”，开始正式获取信号，存储数据。
9．当一定数目的细胞被测定后，获取会自动停止，并会自动存储数据。重复步骤7，继续分析下一个样品，直到所有的样品数据分析完毕。
10.当所有样品分析分析完毕，即换上三蒸水，并将流式细胞仪置于“STANDBY”状态，以保护激光管。
(五)关机程序：
1．从File中选择Quit,退出软件，选择Don’t Save至苹果屏幕。
2．用4ml的1:10稀释漂白水作样品，将样品置于旁位（vacuum is on），以外管吸去约2ml，在将样品架置于中位（vacuum is off），再HIGH RUN 5分钟（内管吸去2ml）。
3．改用三蒸水4ml作样品,同上处理。
4．按Prime三次。
5．此时仪器自动转为STANDBY状态，换2ml三蒸水。必须在仪器处于“STANDBY”状态10分钟后再依次关掉计算机、打印机、主机、稳压电源，以延长激光管寿命，并确保应用软件的正常运行。
6．填写使用登记表。
九、注意事项：本仪器使用空气冷却激光管，因此室温超过30℃以上应打开房间空调后再进行实验，以免影响其正常使用。
