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石蜡包埋技术

2022-06-02  点击:[]

制作石蜡切片,切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中,而水与石蜡又是不相混合的,所以在浸蜡,包埋前必须将组织内所含的水分脱去。而大多数的组织固定剂是水溶液,随后的水冲洗也使其含有大量水分,因此必须先行脱水,一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。由于酒精和石蜡不能混合,须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精,因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状,所以此步骤又称透明。最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。

常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤,即固定,脱水,透明,浸蜡和包埋,前一章中已述过固定。

第一节 脱 水

脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分,为下一步透明及浸蜡创造条件。此外,脱水还可以使组织再次发生一定的硬化,脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。

一.常用的脱水剂

1.酒精:是制片最常用的试剂,可与水在任何比例下相混合,酒精的脱水能力比较强,又能硬化组织。但是酒精的船头速度很快,对于组织会有明显的收缩作用。因此在以酒精作为脱水剂时,应该先从浓度较低的酒精开始,然后递增其浓度,这样可以避免组织过度收缩。

第一瓶酒精浓度随固定剂,脱水组织的大小和种类而异,经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水,从50%酒精开始。如眼球,组胚组织等大多数组织标本则是从70%酒精开始,再经80%,95%以至无水酒精。但是有时为了某种特殊要求,例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本,为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定,而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。

用AAF固定液固定的组织可直接置于95%酒精开始脱水。用醇性固定剂(如Carnoy)则可置于高浓度无水酒精内,但应多次换液以除酸。

一般情况下,组织经过70%,80%,90%,95%,以至无水酒精的脱水程序,即可达到脱水的要求。但是为了能使大量的组织块同时进行脱水,则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用,最好是以两次95%酒精,两次100%酒精重复进行脱水,以保证组织的水分脱净。脱水时间应视组织种类,组织块大小,厚薄和固定剂的不同而异。如脱钙的骨组织,实质性脏器等的脱水过程宜短,而疏松结缔组织,脂肪组织等,脱水过程则宜适当延长。水分必须脱干净,脂肪必须溶去。含有铬酸的固定剂固定的组织,脱水时间不宜过长,而镀银组织更应注意,脱水时间应比为镀银的同类组织要短。

脱水的基本原则:从低浓度酒精开始逐渐升到高浓度酒精,以保持组织中的水分完全脱净。一般1cmX1cmX0.2cm大小的组织,脱水全过程仅需要数小时即可达到完全脱水。在各级浓度酒精内处理的最短时间分别减少到2—4小时也能获得满意的结果。如果组织脱水不尽,随后的透明,浸蜡都会受到影响,致使切片很难以完成。较差质量的切片,很容易造成在染色时脱片,这样的组织蜡块,因其含有一定的水分,一经与空气接触即干燥而凹陷。脱水不尽的组织是不能切出很好的切片的。

外检标本的制作,目前都采用快速脱水的方法。科研标本,教学标本的脱水时间比较长,其目的在于更充分脱水,并适当加强了组织的硬度。

酒精脱水剂使用不宜太久,应适时更换新液。当酒精混浊,变黄或酒精滴于水中出现乳白色混浊时,说明酒精中溶解了过量的脂类,这种情况一出现,将会影响脱水,则应及时更换。

各种浓度酒精的配制:

切片室内应常备有70%,80%,85%等各种浓度的酒精。配制时应以95%酒精作为基液加水稀释,不要用无水酒精去配制,因无水酒精的价格较高,极不经济。

配制方法如下:

1.先将高浓度酒精注入量杯,其量同将要稀释酒精浓度数字相等。

2.加入蒸馏水,致总量达到原酒精浓度的数字量。例如:

(一)用95%酒精配制成70%酒精时:

(1)取95%酒精70毫升;

(2)加蒸馏水使达到95毫升;

稀释后的酒精既为70%的酒精。

(二) 用80%酒精配制成60%酒精时:

(1)取80%酒精60毫升;

(2)加蒸馏水使达到80毫升;

稀释后的酒精既为浓度为60%的酒精.其余类推,其他的试剂的稀释也均可以参照此方法进行配制。

2.丙酮(Acetone):可用作固定液,也是一种比较好的脱水剂。脱水能力强、速度快,可配制不同浓度进行脱水。但一般情况下,多用在无水酒精的补充脱水。

丙酮脱水时间比酒精强,但容易使组织过度硬化,所以应适当掌握脱水时间。

3. 正丁醇(γ-Buty alcohol):正丁醇脱水能力较酒精弱,可与水、酒精相混合,而且也能溶解石蜡,因此正丁醇不仅可以替代酒精使组织脱水,还可以代替二甲苯使组织透明。平常在稀释时都与酒精按照一定比例配制使用,或将组织脱水至90%酒精后移入正丁醇, 正丁醇再脱水后可直接投入石蜡。用正丁醇脱水,组织比较少引起收缩和硬化等不良结果。

4.二氧乙环(Dioxan):二氧乙环是一种有毒物质,易挥发(使用场所必须通风),能同水、酒精、二甲苯相混合并能溶解石蜡,是一种既可以脱水,也具有透明效果的液体。脱水一般可以70%开始,再经过90%至纯二氧乙环,然后浸入石蜡。二氧乙环脱水对组织无收缩和硬化等不良现象,对较硬的组织或易收缩的组织可使用二氧乙环。

二.组织的摇震

为加快脱水进程可将标本放入各级酒精内借助机器或手工震摇,还可以加温促进脱水。即将标本装在塞紧的玻璃瓶置于包埋箱或温箱内,因液体受热产生的正压可增加溶液的对流。但热酒精会使组织过硬,并有爆裂危险,除急诊外,最好不用此方法。

第二节 透 明

组织脱水后,还要经过一个浸蜡的媒剂透明过程。目的是使石蜡渗透到组织中去,达到包埋的支持作用。常用的脱水剂如酒精等,不能溶解石蜡与之相混合,因此必须使用一种既可以同酒精又能同石蜡相混合的媒剂,当组织脱水后,浸蜡之前将组织投入这种媒剂中。由于两剂能相混合,另一方面也由于这种媒剂比酒精比重大,组织中的酒精就被该媒剂取代,待酒精完全被该媒剂完全取代后,组织即成透明状态,因此我们长称这种媒剂为透明剂,在制片中的这一过程就称为透明过程。实质上透明仅是一种过程而非目的,其所以出现透明现象使因其折光系数改变的缘故。从组织的状态上看,由于组织经过媒剂的作用之后,其折射系数近于组织蛋白的折射系数,从而显示出透明状态。组织一旦呈现透明状态,也说明脱水剂已被媒剂所取代。透明后就可以将组织浸入溶解的石蜡进行浸蜡。

透明剂

透明剂很多,一般常用的有二甲苯,苯,甲苯,氯仿,香柏油等。

1.二甲苯:是最为常用的一种透明剂,它能与酒精,丙酮相混合,又是石蜡的溶剂。在透明过程中,组织继续发生硬化,由于二甲苯对组织的收缩性强,作用迅速,因此,组织在二甲苯中时间不宜过长,否则组织容易变脆变硬,一般是达到组织的透明为度,小块组织在半至一小时内透明。为了不使组织过度硬化,苯则。是更好的一种透明剂,它较甲苯和二甲苯的作用稍缓,对组织收缩较少,不易变脆。但苯较二甲苯毒性大,挥发快,故应注意安全使用。

2.氯仿:也是一种很好的媒剂,它的作用缓和。组织在此液内过夜也不至于过硬变脆,这一点较苯,二甲苯和甲苯优良。但氯仿比重较大,折光率较小,不能改变组织的折光率,组织在氯仿中不易呈现二甲苯那样的透明现象,所以组织要比实际需要浸渍更长一些时间保证完全渗透和置换出酒精。

3.香柏油:是研究处理细柔组织的最佳透明剂,因它的硬化作用极小,组织在此液体内较长时间甚至几个月也可无妨。过硬的组织脱水后,(如皮肤和致密纤维组织)用香柏油透明,经此处理后的组织容易切片。不过香柏油的浓度大,渗透力弱,同石蜡混合不及其他透明剂效果好,故常规石蜡切片一般不用。

透明时间的长短因组织的大小而异。例如脑组织和有血块的组织,就应该缩短在二甲苯内留置时间,而一些肌肉组织和胃肠组织则应该稍延长在二甲苯内留置时间,最好先投入酒精和透明剂等量混合液半小时,再入透明剂,并更换一次透明剂,待组织完全透明后进行浸蜡,一般需要半小时至2--3小时。

脂肪组织由于其结构不同透明最快,但是这并不能说明组织中脱水剂已完全被透明剂取代,因脂肪组织本身折光率与透明剂(二甲苯)相近,所以应在透明剂中多浸一段时间使脂肪组织尽可能为透明剂所溶解,才有利于石蜡的侵入。

透明过久是否会导致组织过度硬化变脆,这取决于脱水的彻底与否,如果组织脱水完全彻底,则不会导致过度硬化和变脆,个别含胶样物质过多的组织例外。

第三节 浸 蜡

组织经媒剂的透明作用之后,移入熔化的石蜡内浸渍,石蜡逐渐浸入组织间隙,取代透明剂,这一程序就叫浸蜡。根据所用石蜡的熔点,浸蜡需要能够保持于54-60.C温箱内进行。石蜡的质量和熔度与切片质量密切相关,因此对石蜡的选择应以注意。

用作浸蜡的石蜡不应含有尘粒,杂质及其他异物,不含水分,质地均匀成半透明状,触之感觉滑而不腻,结晶及颗粒少。石蜡中如有水分会结晶而变为白斑可用加热搅拌的方法除去。所有的蜡在使用前按常规必须用标准滤纸在漏斗内过滤到搪瓷杯里储存于浸蜡箱中。最好将石蜡于小锅中加热煮至近沸,冷却再煮反复数次后空气可以排除,挥发性油脂类在煮的过程中挥发。处置后的石蜡置于恒温箱中保持液体状态备用。所用的石蜡有一定的熔点和硬度,熔点高,硬度大。一般要求在 52-56℃之间,这既可以支持硬组织也可使切片成条。使用时应根据组织类型以及制片时的温度和气候而异。夏季采用高熔点的石蜡,冬季则采用低熔点的石蜡。

石蜡的熔点越低,其质地相应的较为疏松。硬蜡(熔点60℃)用于硬纤维组织。软蜡用于胎儿和乳腺组织,这些尽为研究工作的需要。为了增加石蜡的韧性,可在石蜡中加入一些混合剂,常用蜂蜡,硬脂酸,松香等。

1.蜂蜡:又叫黄蜡,是蜜蜂用来造巢的淡黄色蜡,熔点在54℃左右,质地柔软,滑润有韧性。为了使低熔点的石蜡硬一些,可加入10-20%的蜂蜡。它能增加蜡的熔点而不必使组织浸在高温内,便于切片。也要根据组织的种类而异,一般常规用量不超过5%为度。

2.硬脂酸:为有光泽的白色片状结晶体,不溶于水,而溶于乙醇,醚和氯仿。熔点64-71%,在浸蜡中加入少量的硬脂酸可增加石蜡的渗透性。有人用硬脂酸和石蜡混合液置于温箱中代替二甲苯透明。

3.松香:为棕黄色半透明的固体。质硬而脆,遇热熔解,呈胶体状,同石蜡混合时,可增加石蜡的硬度,由于松香质脆,混合后可增加硬度但韧性不足。

组织浸蜡时间也应视组织种类大小和结构不同而异。在整个浸蜡过程中,标本大小对完成浸蜡所需的时间有很大影响。较厚的组织需要较长时间才能使蜡浸入中心,而且厚的组织常带入的透明剂比较多,故需要多次浸蜡才能将透明剂除去。即使少量透明剂也会沾污石蜡而产生结晶,致使切片时切片易碎裂。也要考虑组织的种类,骨,皮肤和中枢神经系统等致密组织要比软组织如肝肾等需要加倍时间。含血多的组织,肌肉和纤维束在蜡内易过硬而发脆,故浸蜡时间应缩短。疏松组织,脂肪,消化道组织等浸蜡时间可以适当延长一些。为了尽可能排除透明剂,浸蜡可以分两级或三级进行。以熔点较低的软石蜡作为第一步,然后再换为熔点较高的石蜡作为第二步,第三步。浸蜡时间1-4小时,或更长,并使之过夜则较易切割,如此浸渍的组织切片在干燥箱内干燥也不易卷曲和龟裂。

第四节 包 埋

包埋,就是将已经经过固定,脱水,透明,浸蜡的组织块从最后的蜡浴取出置入充满熔融石蜡的包埋框内,包埋成块,使组织和包埋剂相熔一体并迅速冷却,这个程序称为包埋。包埋剂凝固后,进一步加强了组织的硬度和韧度而便于进行切片。

一.石蜡包埋法

石蜡包埋法是制作光学显微镜切片的常规方法,它有许多优点,操作简易便于掌握,可进行连续切片,包埋后的组织可以长期保存。

包埋的方法有自动包埋机包埋和手工包埋两种。手工包埋的步骤如下:

1.组织浸入石蜡后,包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。从恒温箱取出置于三角架上,其下点燃酒精灯,以保持石蜡的溶解状态。

2.准备好包埋框,将包埋用的镊子在酒精灯上加温(防止镊子粘蜡)后,左手持蜡杯,右手把加温的镊子放在蜡口(直立状)倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。

3.迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内,切面朝下放正置入框底并轻轻压平,以保证不再有气泡。

4.待石蜡表面凝固前将标签贴于其上,需注意勿使标签与标本混淆,当蜡块冷至蜡面有一层透明蜡膜时,浸入冷水中迅速使其冷却,否则蜡内常形成结晶。

5.蜡块完全硬固后除去铜框,以保证蜡彻底凝固,立即修切,准备制成切片或储藏备用。

二.石蜡包埋的注意事项

1.作为包埋组织使用的石蜡不仅由于气候的不同需要加以选择,而且与组织的硬度也有密切关系,过硬的组织最好用硬度较高的石蜡包埋,反之,软组织则应以硬度较低的石蜡包埋。其熔点一般要求再60。C左右。

2.包埋用石蜡加温不可过高,以保持其不凝固为度,温度过高容易将组织烫坏,使得组织变硬,变脆,并发生卷曲,收缩变形而不利于切片,甚至影响诊断。另外注意埋蜡的温度和组织本身的温度,两者是否合适,温度不一致常可造成组织与周围石蜡脱裂的现象,而达不到包埋的作用。

3.包埋用石蜡应掌握用量,以组织全部包埋完毕,石蜡也恰好用完为宜。

4.包埋应注意组织病变面放在下面,并尽可能使组织放平,在不损伤组织的情况下可用镊子轻压。

5.囊壁和消化道等组织包埋时更应注意组织方位,应将组织块直立拉平,不要卷曲。

6.相同组织如包埋于一个蜡块时,除包平外,还要注意方向的一致,以利切片。

7.多块组织和碎组织包埋于一个蜡块内时,组织的排列一定要密挤靠拢,以求成直线或方块行,这样有利于切片。

8.石蜡包埋后,不宜冷凝过慢,特别是室温较高时,石蜡凝固后应立即投入冷水中加速冷却可增加石蜡密度,韧性和硬度。但冷凝过速也会因为内外温差过大造成蜡块裂损。

三.石蜡包埋程序

1.组织取材2毫米厚度,固定于福尔马林数小时后再换以新鲜福尔马林固定数小时。

在实际操作中,各级酒精脱水的时间可以因组织的大小,多少而减少或延长,如要在酒精中过夜最好是在低浓度酒精中浸泡,透明过程一定适当掌握,不要时间过长。更换脱水酒精,如从节约的角度考虑,可将各级酒精逐级下降使用,如无水酒精可降为95%酒精在继续使用。应考虑到组织在酒精中脱水过程里,除去组织中的水分混入酒精,使其浓度降低外,组织中的一些可溶物质,如脂类也可被酒精溶解,酒精中含有一定这样的物质时,将会降低脱水功效,因此,最好是更换酒精。

组织脱水,透明彻底后,浸蜡过程在必要时候可以延长,例如,在石蜡中过夜,但温箱一定要恒温,以免组织块受高温影响,造成组织过度硬化。

四.快速石蜡包埋法

快速切片诊断是在数十分中或半小时左右制成切片并作出诊断的一种手段,主要用于手术中决定手术的切除范围和手术方式。快速切片的方法包括冰冻切片和快速石蜡切片。

制作快速石蜡切片时,切取组织应该薄小,从固定、脱水到浸蜡的全过程都要加温,一般是先将各种试剂在超声波快速石蜡脱水仪中预热,恒温下操作,整个过程大约在10-15分钟即可完成。

操作过程:

(1)先取病变组织于AAF中固定3-5分钟。

(2)95%酒精1分钟。

(3)无水酒精1分钟

(4)正丁醇1/3丙酮2/3混合液1分钟

(5)二甲苯1分钟

(6)浸蜡1-2分钟

(7) 包埋,将组织置于预先备置的蜡块中(固体石蜡包埋法);预备一硬蜡块,用热镊子于蜡块中间熔蜡一小部分,在以热镊子从蜡杯内取出已与石蜡饱和之组织块投入融蜡中,冷固后,立即进行石蜡切片。石蜡切片附贴后,在火上稍加烘烤使组织切片上石蜡全部熔化,水分也被烘干,然后投入二甲苯,100%酒精,95%酒精各30秒脱蜡,入水冲洗,常规苏木素,伊红染色。

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