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石蜡切片常见问题及石蜡免疫荧光步骤

2015-12-04  点击:[]

石蜡包埋制片术是组织切片制作最常用的一种技术。其基本步骤包括取材、固定、脱水、浸蜡、包埋、切片、染色和封片等,其中切片是最重要的环节。我们在工作实践中发现,切片制作过程中常常由于多方面的原因在切片这一环节中遇到困难,甚至导致制片失败。针对切片过程中出现的问题,我们积极寻找原因,探究解决问题的方法。现以问题一原因一解决方法的模式,报道如下。

1 切片上卷且不能形成连续蜡带原因:①切片刀不够锋利。②切片刀与蜡快的角度不当。③蜡块四周留蜡边太少。④石蜡硬度过大,黏度不够。解决方法:① 重新磨刀。②调整切片刀的角度。③可重新包埋或将蜡块四周熔化,再放入包埋框中补蜡,修理蜡块时组织块周围保留的石蜡以2mm左右为宜。④蜡块过硬可适当加些蜂蜡,或更换熔点较低的石蜡重新包埋。

2 切片弯曲且不能形成直带 原因:①蜡块上下或左右两边不平行。②蜡块与切片刀刀口不平行。③组织块外形不整齐。④切片刀各处的锋利程度不一致。解决方法:①将蜡块四边反复修平对称。②调节蜡块夹持器,使其与切片刀平行。③修整组织块时,注意修切整齐。④移动切片刀,更换刀口位置。

3 切片上出现裂纹 原因:① 切片刀上有小缺口,或刀口不平整。②组织中可能含有较硬之物质,如固定液之结晶石灰质。③包埋时石蜡冻结太慢。解决方法:①切片刀某处有缺口,可调换刀口部位或重新磨刀。刀口上缺口过多且不平整,可先将刀锋垂直在磨刀石上轻轻磨数次,然后按常规磨刀田。②组织中硬性物质太多,则不宜用。③纠正包埋时的缺点。一般待蜡块周围凝结一层,即可放入冷水中。

4 切片粘在切片刀上或蜡块上且不易取下 原因:切片时有静电作用,产生静电吸引,在冬季或气候干燥时常出现这种情况。解决方法:可用加湿器.以增加空气中的水分,而减少静电作用。

5 切片厚薄不均 原因:①切片微动部分失灵,齿轮跳格。②蜡块太大,过硬,转动时刀刃受震动。解决方法:①修理切片机失灵的部分,调整螺旋.加机油润滑零件,必要时需请专业技术人员调整切片机。②如蜡块过大,以后取材时注意取材的大小。蜡块组织过硬,可返回水中浸泡,再重新脱水和包埋。

6 切片碎烂或组织脱出并与石蜡分离 原因:①组织脱水,透明不够。②浸蜡时间过长.浸蜡温度过高。③组织脱出是由于脱水、透明时间不够,或组织中含有乙醇等,石蜡不易渗入组织中.故导致石蜡与组织分离。④二甲苯使用时间过久。解决方法:①必须按组织大小厚薄选择脱水、透明时间。②依组织的性质和结构特点确定浸蜡时间.控制包埋温度。一般这种情况难以补救。③脱水,透明渗蜡不够,应重新熔化,退回入二甲苯和酒精,再进行渗蜡包埋。④更换二甲苯。

7 切片皱褶太多且不能完全展开 原因:①石蜡太软或室温过高。②切片刀上粘有残余的石蜡,刀口不干净。③组织浸蜡时间不够.或脱水、透明不够。④切片刀不锋利。解决方法:①可将蜡块放入冰箱中冰冻后切片.并在切片时一边切片一边用冰块冰冻或换蜡。如室温过高,可开空调降低室温。②切片刀不干净,可用棉花沾少许二甲苯将刀口拭干净。③组织浸蜡不够,可重复浸蜡过程。④将切片刀磨锐利再行切片。

石蜡切片免疫荧光步骤:

包埋好的标本用切片机切石蜡切片(5微米),并将蜡片贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片上。

经60℃烘片2-8小时(都试过,没啥差别,但非实质性器官应适当延长时间)。

二甲苯Ⅰ脱蜡30分钟(若要保证脱蜡完全可将其加热至40-60℃),二甲苯Ⅱ脱蜡10分钟。

梯度酒精复水:100%酒精3分钟,100%酒精3分钟,95%酒精3分钟,85%酒精3分钟,75%酒精3分钟, 50%酒精3分钟,蒸馏水3分钟,蒸馏水3分钟,PBS 5分钟。

进行抗原修复:将切片置于0.1mol/L且ph=6.0的枸橼酸液修复液中,用微波炉100火力三分钟至微微沸腾,再用50火力维持7分钟,停止加热后自然冷却20-30分钟。

用PBS 3分钟,用滤纸擦去标本外的PBS,滴加封闭血清(无色的5�S或免疫组化试剂盒北京中衫中的封闭液)在湿盒中37℃封闭30分钟(室温30分钟也可)。

用滤纸擦去封闭液,勿洗。滴加适宜浓度的一抗置湿盒中4℃孵育过夜(37℃1小时多也差不多),再用PBS 3分钟×5次洗去一抗,用滤纸擦去标本外的PBS。

滴加荧光二抗室温置湿盒中避光孵育1小时,用PBS 3分钟×3次洗去二抗,用滤纸擦去标本外的PBS。

滴加DAPI 避光孵育2分钟,可对标本进行显核,蓝色荧光,效果极佳。用PBS 1分钟×3次洗去DAPI,用滤纸擦去标本外的PBS。

最后用含甘油封片,并在荧光显微镜下立即观察。

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