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激光扫描共聚焦显微镜基本原理及应用

2014-09-23  点击:[]

激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有划时代的高科技新产品,它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置,利用计算机进行图像处理,把光学成像的分辨率提高了30%~40%,使用紫外或可见光激发荧光探针,从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像,在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值,膜电位等生理信号及细胞形态的变化,成为形态学,分子生物学,神经科学,药理学,遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等,能够进行活体细胞中离子和PH值变化研究(RATIO),神经递质研究,荧光原位杂交研究(FISH),细胞骨架研究,基因定位研究,原位实时PCR产物分析,荧光漂白恢复研究(FRAP),胞间通讯研究,蛋白质间研究,膜电位与膜流动性等研究,完成图像分析和三维重建等分析。

激光扫描共聚焦显微镜目前主要应用的研究范围: 细胞形态学分析【观察细胞或组织内部微细结构,如:细胞内线粒体、内质网、高尔基体、微管、微丝、细胞桥、染色体等亚细胞结构的形态特征;半定量免疫荧光分析】;荧光原位杂交研究;基因定位研究及三维重建分析。

1. 基本原理

传统的光学显微镜使用的是场光源,标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰;激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描,标本上的被照射点,在探测针孔处成像,由探测针孔后的光电倍增管(PMT)或冷电耦器件(cCCD)逐点或逐线接收,迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔,焦平面以外的点不会在探测针孔处成像,这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面,克服了普通显微镜图像模糊的缺点。

在显微镜的载物台上加一个微量步进马达,控制载物台的升降,可使载物台上下步进移动,最小步进距离为0.1um,则细胞或组织各个横断面的图像都能清楚地显示,实现了“光学切片”的目的,这就是“细胞CT”名称的由来。

2.激光扫描共聚焦显微镜在医学领域中的应用

2.1在细胞及分子生物学中的应用

2.1.1 细胞、组织的三维观察和定量测量 共聚焦显微镜的分辨率超过普通光学显微镜,染色过程简便,可以在活细胞上进行无创伤性的染色,最大程度地维持细胞的正常形态。多种自发性的荧光染料,已被广泛地用于诸如RNA、DNA细胞核、线粒体、内质网、肌动蛋白、细胞膜等结构的标记。运用免疫荧光技术,将不同波长的两三种荧光物质标记在内部不同结构的相应抗体上,以这几种荧光物质特定的光谱特性选择激发光和滤光片,则可以观察到细胞内部各结构间的毗邻关系。特别是在荧光着丝点易被遮盖(如荧光原位杂交实验)的情况下,这种三维图像的多角度观察提供了极大的优越性。

细胞有丝分裂中细胞核内染色体数目(双倍体、多倍体)、形态和位置的变化,一直是细胞生物学肿瘤研究中的热点。着丝点是细胞核内的重要结构,被认为在有丝分裂中起重要的作用,应用共聚焦显微镜的定量测量技术,可以较精确地测定着丝点在不同分裂期的位置。

共聚焦显微镜生成厚度小于0.2微米的依次相连的光学切片,即使较厚的组织的三维数据也可被计算机获取,运用适当的图像分析软件,可以测量并确定所观察结构的表面特征,体积等参数,为相互结合定量测量提供了新手段。

2.1.2 活细胞生理信号的动态监测: 活细胞的功能监测在细胞生物学、神经生理学、药理学等领域都有重要意义。许多荧光染料可以聚集在细胞的特定结构,而对细胞的活性基本上不产生影响。可以利用这一特性来反映细胞受到刺激后形态或功能的改变。如亲脂性染料DiOC6(3)主要聚集在内质网,且对细胞的毒副作用极小。肌细胞中的肌浆网与ER有相同的属性,是胞内钙库,应用共聚焦显微镜,就可以动态观察肌细胞兴奋时SR的变化。许多参与神经元兴奋传导的离子如K+、Na+、Ca2+及H+、Cl-、Mg2+等,都有其自发性的荧光染料。Ca2+在细胞的兴奋、分化、死亡等过程中都起重要作用,是许多生理反应的胞内第二信使,是目前研究得最为充分的离子; 通过激光扫描共聚焦显微镜对胞内、核内钙转移的研究、对心肌细胞的钙变化研究、免疫细胞钙信号的研究、对Ca2+信号在凋亡细胞中作用的研究都取得了可喜的结果,而更多的研究则是将激光扫描共聚焦显微镜应用于神经生物学中对神经元Ca2+动态测量的研究。目前激光扫描共聚焦显微镜以其独特的优势成为钙研究中的重要手段之一。

2.1.3 粘附细胞的分选(adherent cell sorting) 对特异细胞的分选和克隆,是研究单个细胞或细胞系生物特性的先决条件。 将细胞贴壁培养在特制培养皿上,培养皿底部有一层特殊的膜,用高能量激光在欲选细胞四周切割成八角形几何形状,掀去培养皿底部的膜,非选择细胞则被去除。目前对粘附细胞分选方法多用于对杂交瘤和突变细胞的分选,也有用于对经转化的平滑肌细胞,卵巢癌细胞及人畸胎瘤干细胞等的分选和克隆,还可用于基因调控、基因治疗等研究。

2.1.4 细胞激光显微外科和光陷阱功能: 激光扫描共聚焦显微镜可将激光当作一把“光刀子”使用,完成诸如细胞膜瞬间穿孔,染色体切割,神经元突起切除等一系列细胞外科手术。光镊是利用激光的力学效应,将一个微米级大小的细胞或其它结构钳制于激光束的焦平面上,也称为光陷阱。光镊可以用来进行细胞融合(如卵细胞受精)、机械刺激或细胞骨架弹性测量等,特别是在测量植物细胞的细胞骨架时很有意义。

2.1.5光漂白后的荧光恢复(FRAP): 细胞在相互接触后彼此间即有低阻抗的通道形成,以进行细胞间通讯;被经合成肽测试法证明只允许低于1.5KD分子通过的通道被称作缝隙连接。缝隙连接是存在于相邻细胞间的一类蛋白通道,普遍认为缝隙连接通过介导细胞间的信息传递,在诸如增殖、分化、代谢等过程中发挥极其重要作用。FRAP技术借助***度脉冲式激光照射细胞的某一区域,从而该区域荧光分子的光淬灭,该区域周围的未淬灭的荧光分子将以一定速率向受照区域扩散,而此扩散速率可通过低强度激光扫描探测。在研究细胞骨架构成、跨膜大分子迁移率、细胞膜流动性、胞间通讯等领域中有较大的意义。

2.1.6在细胞凋亡研究中的应用

细胞凋亡是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程,细胞凋亡作为生理性、主动性过程,能够确保正常发育、生长、维持内环境稳定,发挥积极的防御功能。用激光扫描共聚焦显微镜观察凋亡细胞,可见凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩,细胞核变小,出现染色质沿核膜内侧排列的核边聚集现象。细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。

细胞凋亡(Apoposis)是生物体内广泛存在的,由细胞特定基因控制,以细胞DNA 降解为特征的细胞自发过程,与机体中多种生理及病理过程密切相关。因而,对Apoposis 的研究现已成为研究细胞生物学研究的热点之一。而激光扫描共聚集显微镜结合众多荧光探针的应用,成为细胞Apoposis超微结构及分子水平变化的有力手段

2.2在神经科学中的应用

2.2.1定量荧光测定:对活细胞进行定量测定,具有很好的重复性,分析神经细胞和胶质细胞的某些物理及生物化学特性;监测抗原表达,细胞结合和杀伤等特征。在多发性硬化病人大脑活检标本上观察病变组织的微血管内皮细胞特异性地表达。

2.2.2细胞内离子的测定:使用多种荧光探针,对神经细胞的Ca2+、pH及其它各种细胞内离子进行定量和动态分析。

2.2.3 神经细胞的形态学观察:激光扫描共聚焦显微镜使用模拟荧光处理,可将系列光学切片的数据合成三维图像,并可从任意角度观察。如Joshi等观察了细胞突触的骨架的三维图像。三维重建图像可使神经细胞及细胞器的形态学结构更加生动逼真。

2.3 在耳鼻喉科学中的应用

2.3.1 在内耳毛细胞亚细胞结构研究上的应用:1993年Ikeda等应用激光扫描共聚焦显微镜研究内耳毛细胞的亚细胞结构,用Rhodamine 123染色,见线粒体分布于表皮板下和核下,加入1mmol/L三硝基酚使线粒体膜电位减小,荧光强度明显减弱。用DIOC6(3)染色,观察到内质网分布于表皮板下直至细胞核区域,呈网状、核下及侧膜下也有分布,胞质中则极少,探讨了蛋白激酶(PKC)在三磷酸肌醇/钙信号系统中的作用。

2.3.2 激光扫描共聚焦显微镜的荧光测钙技术在内耳毛细胞研究中的应用

钙离子在细胞的生命活动中起着重要作用,它参与调节细胞功能,如肌肉收缩,细胞运动,递质合成与释放,信息传递,细胞换能等。激光扫描共聚焦显微镜的荧光测钙技术可探测到细胞内钙浓度的细微变化,当内耳毛细胞受到各种生理及病理因子刺激时,可用荧光测钙技术观察细胞内钙离子浓度的变化。为研究毛细胞的机能提供了新的手段。

2.3.3激光扫描共聚焦显微镜在内耳毛细胞离子通道研究上的应用

Issa等用膜片钳的全细胞记录法将Fluo-3已导入毛细胞,用激光扫描共聚焦显微镜观察,当毛细胞去极化时其底部侧膜上平均有18个亮点(钙内流所至),然后对同一毛细胞进行连续超薄切片电镜观察,证明这些亮点即为突触前活性区。

2.3.4 激光扫描共聚焦显微镜在嗅觉研究中的应用:Schild等用激光扫描共聚焦显微镜和钙荧光探针研究嗅觉感受器神经元的钙通道分布,以Fluo-3和Fura-red 染色后行双发射比例测量,测出其胞内游离钙呈不均匀分布,观察显示嗅觉感受器神经元的钙通道位于胞体部,与同一部位的钾通道一起构成适应性调节机制,而对树突尖端纤毛的钙依赖性换能过程无干扰。

2.4 在肿瘤研究中的应用

激光扫描共聚焦显微镜的出现,在一定程度上推动了肿瘤的研究进展。它为肿瘤细胞生物学、分子生物学、细胞通讯、细胞形态学研究、细胞的抗药物代谢、细胞膜及其受体等领域的研究,提供了有效手段。

2.4.1定量免疫荧光测定:激光扫描共聚焦显微镜采用免疫荧光对肿瘤细胞的抗原表达、细胞结构特征、抗肿瘤药物的作用及机理等方面进行定量的观察和监测,为较理想的形态学观察方法。先采用荧光标记特异性抗原或抗体,使其与特异性抗体或抗原结合,再采用激光扫描共聚焦显微镜对其进行定性、定量和形态学分析。近年来报道较多的是P53肿瘤相关抗原等的定位、定性和定量分析。采用荧光标记某些蛋白分子,然后测定其平均荧光强度和积分荧光强度,从而对某些细胞结构蛋白分子进行定量分析。

2.4.2 细胞内离子分析

激光扫描共聚焦显微镜可以准确地测定细胞内Ca2+、 K+、 Na+、 Mg2+、 pH等的含量。但在肿瘤细胞中研究报道较多的为Ca2+的测定,通过测定Ca2+的胞内浓度,可以了解肿瘤启动因子、生长因子对肿瘤细胞的刺激反应。

2.4.3 图像分析:肿瘤细胞的二维图像分析:激光扫描共聚焦显微镜有较好的分辨率,因此其二维图像非常清晰,采用无损伤光学切片,可显示肿瘤细胞各层面的图像,亦可充分显示肿瘤细胞内线粒体、内质网、高尔基体、微管、微丝、细胞桥、染色体等亚细胞结构的形态特征.近年来,激光扫描共聚焦显微镜在肿瘤研究中应用最多的为某些特殊蛋白或亚细胞结构的细胞内定位。如Bu-G等采用激光扫描共聚焦显微镜对瘤细胞内的一种受体相关蛋白进行了亚细胞水平的定位和功能分析,取得了较好的实用效果。同时,激光扫描共聚焦显微镜还可用于肿瘤细胞的细胞面积、细胞周长的测定和细胞核面积等的测定,从而使形态学研究更为客观。

2.4.4 三维重建:激光扫描共聚焦显微镜可以将各层面的细胞图像进行三维重建和处理。从而,可以分析肿瘤细胞的三维立体特征,亦可研究肿瘤细胞内亚细胞结构的立体形态学变化及其空间关系。同样,激光扫描共聚焦显微镜亦可用于肿瘤细胞核和染色体的三维立体形态研究。如:Gilbert N等采用激光扫描共聚焦显微镜对RNA多聚酶和DNA进行了空间三维定位。

2.5 激光扫描共聚焦显微镜在内分泌领域的应用

2.5.1 细胞内钙离子的测定:利用激光扫描共聚焦显微镜,借助Ca2+荧光探针indo-1或fura-2对单个的垂体促性腺激素细胞内Ca2+浓度进行了测定,并观察了白介素-b(IL-b)的作用,结果发现IL-b可增加混合的垂体细胞群中促性腺激素细胞的基础Ca2+水平,并增强该细胞自发的Ca2+浓度波动(Ca2+震荡)。提示IL-b可通过间接的旁分泌机制影响促性腺激素细胞Ca2+动员。

2.5.2 免疫荧光定位及免疫细胞化学研究:借助特定的与抗体结合的荧光探针,利用激光扫描共聚焦显微镜可对细胞内某些成分(抗原)进行免疫荧光定位及定量分析。如利用激光扫描共聚焦显微镜对垂体生长激素(GH)和泌乳素(PRL)混合瘤组织切片进行观察,以抗GH和PRL抗体作免疫标记,再加入与荧光染料罗丹明(GH)和FITC(PRL)双标记的二抗,结果发现垂体泌乳素生长素细胞可同时检测到罗丹明和FICT荧光信号,并且证实在同一分泌颗粒内同时有罗丹明和FICT信号,这一研究证明垂体泌乳生长素细胞同一分泌颗粒内同时存在GH和PRL。

2.5.3细胞形态学研究:利用激光扫描共聚焦显微镜,借助于特定的荧光探针,可对细胞及细胞内部结构进行形态学分析。如利用激光扫描共聚焦显微镜对纯化的生精细胞平均大小进行了测量,发现精母细胞大小在225~500um2,精子大小在100~225um2之间。

2.6 在血液病研究中的应用

观察血液和骨髓细胞的形态及功能变化是血液学研究的主要内容,在这个领域激光扫描共聚焦显微镜有着广泛应用。

2.6.1 在血细胞形态及功能研究方面的应用

经典的形态学手段如普通光学显微镜、相差显微镜及电子显微镜,仅能观察细胞的形态,而不能检测其功能,即使是荧光显微镜也仅能对细胞表面的荧光进行定性分析,而激光扫描共聚焦显微镜可对粘附(贴壁生长)的单个细胞或细胞群的胞内、外荧光作定性甚至定量、定位、实时分析,从而对细胞内组分如线粒体、内质网、高尔基体、DNA、RNA、Ca2+、Mg2+、Na+等的分布、含量等进行测定,并可进行动态观察,对受刺激后的细胞及其组分变化进行实时动态观察,使细胞结构和功能方面的研究达到分子水平。如利用激光扫描共聚焦显微镜和荧光标记的染色体特异性探针杂交定位对人T 淋巴细胞进行观察,发现在细胞周期的G1期着丝点核膜周边,并经常与核膜接触,而端粒区却位于核中心,未见到由于同源染色体配对,当细胞向G2期转化时,着丝点向核中央移位,染色体凝聚,并出现空染区,首先证实了在有丝分裂前染色体就有明显的三维结构变化。

在急性早幼粒细胞白血病中PML蛋白是存在于核小体内的与白血病发生密切相关的蛋白,它的受抑可能会导致早幼粒细胞性白血病细胞的生长失控,Chelbi Alicx等用激光扫描共聚焦显微镜发现干扰素可诱导PML蛋白的表达,PML蛋白可传递干扰素的抗分化作用,从而抑制白血病细胞的生长,由此揭示了干扰素抵制急性早幼粒细胞性白血病细胞恶性生长的机理。

2.6.2 在细胞凋亡研究中的应用:细胞凋亡是正常细胞维持群体数量稳定、清除转化细胞、防止癌变及胚胎发育和免疫系统中克隆选择所必需的生理现象。它的异常与许多疾病的发生发展有关;用共聚焦显微镜观察到凋亡细胞的细胞器是完整的,并保留了胞膜表面的免疫活性,Torigoe等使用激光扫描共聚焦显微镜发现激活的T淋巴细胞与抗原一接触,就可触发胞内Ca2+的浓度迅速上升,从而诱导凋亡。Kressel将DNA片段3,端荧光标记,结合激光扫描共聚焦显微镜观察放线菌素D诱导的K562细胞的凋亡,发现与细胞坏死过程明显不同,凋亡初期,核内的非核仁区DNA片段沿核膜呈新月状分布,核仁无变化,凋亡加速期,细胞核变成几个强染标记的圆形小体,而NaN3或快速冻融引起坏死的细胞无此变化。

2.7 在眼科研究中的应用

2.7.1 利用激光扫描共聚焦显微镜观察组织、细胞结构

2.7.1.1观察晶状体细胞、组织结构及其变化规律,在特定的条件下,证实线粒体与核在晶体上皮细胞、纤维细胞的分化过程中同步破坏、消失的关系。

2.7.1.2结合特殊的荧光染色在活体上观察角膜外伤修复中细胞移行及成纤维细胞的出现;观察放射性角膜切开术后,角膜上皮及成纤维细胞中f-肌动蛋白、非肌凝蛋白、表面膜和细胞外纤维结合素等的分布及变化以及它们在伤口收缩过程中的作用。

2.7.1.3利用激光扫描共聚焦显微镜观察视网膜中视神经细胞的分布以及神经原的树枝状形态。观察证实肌凝蛋白在视网膜色素上皮(RRE)运动中的作用,观察经过培养的视皮质神经细胞中M1受体的分布情况及外界对它的影响。

2.7.2三维重建:利用激光扫描共聚焦显微镜能在活体上保持标本不受损害性干扰的情况下,对标本作连续的光学切片,将收集到的图象经过计算机软件的分析,作出三维重建的图像,得到较为清晰的立体结构图像。如Rummelt用双重荧光染色的方法,分别着染了葡萄膜黑色素病中的肿瘤实质细胞和血管,然后通过三维重建,清楚地观察到肿瘤和微血管的关系,并以此为依据判断肿瘤的进程。

2.8 激光扫描共聚焦显微镜在肾脏病中的应用

利用激光扫描共聚焦显微镜可以系统观察正常人肾小球系膜细胞的断层扫描影像及三维立体影像水平,使图像更加清晰,从计算机分析系统可从外观到内在结构,从平面到立体,从静态到动态,从形态到功能几个方面对系膜细胞的认识得到提高。为深入研究系膜细胞的生物学提供一个崭新的方法。

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