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HE染色步骤

2022-06-02  点击:[]

苏木素-伊红染色(HE染色法)

整个染色过程包括五个内容:脱蜡,染色,脱水,透明和封固。

(一)脱蜡:

1.从温箱中取出烤干的切片,立即投入二甲苯中脱蜡5~10min(可在二瓶中进行),脱蜡时间长短取决于蜡是不彻底溶解。气温低可延长时间,气温高可适当缩短时间或在温箱中加速脱蜡。

2.移入无水酒精(100%)(二瓶)中,约2min。

3.移入90%酒精中(二瓶),约2min。

4.移入80%酒精中(二瓶),约2min。

5.移入70%酒精中,约2min。

6.移入水中,洗去酒精,约2~3min。

7.移入蒸馏水中,约2min。

(二)染色:

1.移入苏木素中,浸染8~15min,一般以稍深染为宜。

2.移入水中,洗去苏木素和浮色,约1~2min。

3.移入分化液(1%盐酸酒精)中,分化几秒至30秒钟, 使切片褪色至淡兰红色即可。分化的作用,可使细胞浆兰色脱去,而细胞核更加清晰,鲜丽,分化不足时,胞浆带兰,胞核过染,分化过度时,胞核太淡,难以辩认,可再退回苏木素染液, 延长一定时间。

4.移入流水中,洗涤30~60min,使组织呈鲜兰色或天兰色(兰化)。

5.移入伊红液中,浸染2~5min,如着染缓慢 , 可在伊红液中加入冰醋酸 (100ml伊红液加1~2滴冰醋酸)以助染。

6.移入水中,洗去伊红浮液,并用纱布擦净玻片上的多余染料。

(三)脱水:

1.吸去玻片上的水分后多入80%酒精中,(二瓶)脱水,约1~2min, 如在酒精中褪色很快时,可迅速移入90%酒精或返回伊红液中复染。

2.移入90%酒精中(二瓶)脱水,约2~4min。

3.移入无水酒精(100%酒精)(二瓶)彻底脱水,约4~8min。

(四)透明

1.移入二甲苯Ⅰ中透明3~5min。

2.移入二甲苯Ⅱ中透明5~10min。

(五)封固:

用树胶封固,先从二甲苯Ⅱ中取出切片,将组织外围的二甲苯迅速擦去,在滴上一滴树胶于组织片上,然后取干净的盖玻片,仔细加在封固剂上,慢慢压平, 使盖片位置适中。切片封固后,放在温箱中烤干,或平置凉干后装盒。

注意事项:为使切片制作更符合质量标准或最佳。除按步骤严格进行外, 还应注意以下几点:

<1>.用含升汞的固定液固定的组织块,在切片染色前,应进行脱汞,具体方法:切片脱蜡,逐次进入70%酒精后,入稀碘液(碘1克,碘化钾2克,蒸馏水3000ml)内5~10min。蒸馏水稍洗,入5%硫代硫酸钠溶液内5min。蒸馏水充分洗后进入染色。

<2>.组织块在4~5倍稀释的福尔马林液中固定过久,经常产生一种褐色素 ,叫福尔马林色素。这种色素不溶于水和酒精,但影响组织观察。以在脾、肝、肺发生充血、出血和渗血的组织中最常见,因此,切片在染色前经脱福尔马林色素的步骤。其方法:切片脱蜡,浸水后,投入伟勒卡依氏溶液(1%氢氧化钾液1ml, 75%酒精200ml)20分~2h ,充分水洗后染色。

<3>.如组织片含有大量黑色素时,影响染色和检查,可在脱蜡后,浸水后用0.25%高锰酸钾胶2~4h ,然后,常水充分洗涤,或经1%草酸液脱去切片上的黄褐色后,再充分水洗,后进入染色。

<4>.在切片染色后,进行脱水时,当通过90%酒精后,应对切片进行仔细擦试,此时,把切片中组织片周围的污染涂色或水分用纱布(清洁)擦干净。当切片从 100%酒精出来时,也要认真仔细擦去污物及组织片附近的水分。这样即可使组织脱水彻底,还可使酒精浓度不至明显降低尽量保持酒精原浓度。

<5>.封固时,可使灵活操作,一种方法是先在盖玻片上滴半滴树胶,再将载玻片从二甲苯Ⅱ中取出。擦去切片外围的二甲苯,翻转载玻片, 使有组织的一面朝下,正好与盖玻片对准组织片,当盖玻片被粘附在载玻片下面时,翻转载玻片, 压平盖玻片,并置于位置适中。另一种方法, 将载玻片从二个苯Ⅱ中取出擦去外围的二甲苯后,立即在组织片上滴上半滴树胶。然后用小镊子挟取一盖玻片, 翻转盖片并轻轻从酒精灯火焰上通过二次,再翻转过来, 从载玻片上组织片一端轻轻放下,当盖片接触树胶时,可将盖片放下,树胶可自然扩散整个盖片, 此时注意调整适当位置。如有气泡可轻轻压盖片从一侧挤出。注意树胶的量不宜过多,防止外溢,也不可过少,防止封闭不全。

十.常用双重及多色染色剂组成与配制:

(一)苏木素----伊红染色剂:

苏木素 2克

100%酒精 100ml

甘油 100ml

冰酸酸 10ml

钾明矾 3克

蒸馏水 100ml

将苏木素溶于酒精中,再加甘油和冰醋酸,把钾明矾在研钵内研成粉末,溶于蒸馏水,倾入苏木素液,用玻璃棒搅匀,混合液为淡红色,即成熟,此液可长期保存。

(二)Mager氏苏木素液:

苏木素 1克

碘酸钠 0.2克

钾明矾 50克

水合氯醛 50克

蒸馏水 1000ml

柠檬酸 1克

将苏木素及碘酸钠用蒸馏水加温溶解,呈樱 桃红色,再加入钾矾, 使溶液变为兰紫色,煮沸5min后,再加入水合氯醛搅拌,此时液体变为红紫色,溶解完后加入柠檬酸,取下冷却,滤过后即可使用。此液能长久保存。

(三)Harris氏苏木素液:

苏木素 0.9克 铵明矾(或钾)20克

甲液 无水酒精 10ml 乙液 蒸馏水 200ml

一氧化汞 0.5~1克

甲、乙两液分别溶解,然后两液混合,加热熬沸,再加入一氧化汞, 以玻棒搅至溶液呈深紫色,置于凉水中急速冷却,静置一夜后,滤过密封保存。用前若加入少许5%冰醋酸,则染色效果更好。此液经2~3个月后,着色力减退,故宜少配。

(四)伊红染液:

伊红染料有水溶性和酒精性两种,伊红Y为水溶性的。

1.伊红水溶液:

伊红Y 0.5克

蒸馏水 100ml

伊红Y 0.5克

蒸馏水 100ml

95%酒精 25ml

2.伊红酒精液:

伊红 0.5克

80%酒精 100ml

3.分化液:盐酸1ml加入70%酒精99ml即成。

(五)Mallory 三色染色法

此染液适宜用Zenker氏液固定的组织,如果是福尔马林固定的组织, 则在切片染色前浸入重铬酸钾醋酸液媒染20~30min。

苯胺兰 0.5克 橘黄G 2克

磷钙酸 1克 蒸馏水 100ml

将蒸馏水分成三份,分别溶解上述三种染料,然后将三液混合即成。

染色步骤:

(1)切片脱蜡,浸水;

(2)脱汞后水洗;

(3)入苏木素染液,1%盐酸分化,水洗 兰化;

(4)入0.5~1%酸性复红液5~30min,水洗 至红色不退;

(5)蒸馏水洗30秒钟以上,入买洛里氏染色液20min,流水冲洗2~5min;

入95%酒精分化,入无水酒精脱水,二甲苯透明,封固。

结果:胶元纤维, 网状纤维呈深红色、粘液、淀粉样物呈淡兰色,纤维素、 肌纤维、胶质纤维酸性颗粒呈红色.红细胞、髓鞘呈红色,细胞核呈兰色。

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