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RT-PCR实验步骤

2022-06-02  点击:[]

一、组织抽提:

1. 取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末

2. 移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆

3. 移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打

4. 冰上孵育5分钟

5. 离心12,000g 4℃ 5分钟 取上清液移入1.5ml新离心管

6. 加0.2 ml氯仿,震荡,冰上孵育5分钟

7. 离心<12 ,000g 4℃ 10分钟 取上层液相移入1.5ml新离心管

8. 加0.5 ml异丙醇,震荡,冰上孵育5分钟

9. 离心<12 ,000g 4℃ 5分钟 弃去上清液

10. 加入1 ml 75%乙醇,震荡

11. 离心<7 ,500g 4℃ 5分钟 弃去上清液

12. 室温下使之变透明

13. 加入DEPC处理水10μl --35μl 溶解RNA( 可保存在液氮或低温冰箱)

14. 走RNA变性电泳观察18s,28s条带,分光光度计检测260/280吸光度比值,计算RNA浓度

二、RT反应体系(第一步):约20分钟

RNA 抽提物

5μl

Radome 引物

2μl

RNA sin

0.5μl

1. 65℃ 15分钟

2. 立即放入冰浴

RT反应体系(第二步):约2小时

RNA sin

0.5μl

10mM dNTP

1μl

5×RT 缓冲液

4μl

25mM MgCl2

4μl

AMV 逆转录酶

3μl

1. 37℃ 1.5小时

2. 94℃ 5-10分钟

3. 反应物保存于-20℃或进行PCR

1PCR反应体系:约4.5小时

25mM MgCl2

2μl

10×PCR 缓冲液

5μl

10mM dNTP

1μl

上下游引物10pmol/μl

2.5μl×2

CDNA模板

2.5μl

ddH2O

34μl

Taq酶

0.5μl

轻质石蜡油

50μl

100μl

1. 94℃ 2分钟,55℃ 1分钟,72℃ 2分钟 为第一个步1个循环

2. 94℃ 45秒,55℃ 40秒,72℃ 1分钟 为第二步30个循环

3. 72℃ 10分钟

4. 取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳

2PCR反应体系:约5小时

25mM MgCl2

3μl

10×PCR 缓冲液

5μl

10mM dNTP

1μl

上下游引物10pmol/μl

2.5μl×2

CDNA模板

5μl

ddH2O

30μl

Taq酶

1μl

轻质石蜡油

50μl

100μl

1. 94℃ 2分钟,55℃ 1分钟,72℃ 2分钟 为第一个步1个循环

2. 94℃ 45秒,50℃ 40秒,72℃ 1分钟 为第二步40个循环

3. 72℃ 10分钟

4. 取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳

四、电泳:约1.25小时

1. 配0.5×TBE电泳缓冲液300 ml

2. 胶浓度1.7%(40ml 0.5×TBE加0.68g胶)

3. 微波炉中火2分钟溶解胶

4. 冷却至60℃加入溴乙锭2μl(10mg/ml的终浓度0.5μg/ml)

5. 放入梳子,浇板,待凝固

6. 加8μl PCR反应产物+2μl溴酚兰

7. 电泳50-80V(每㎝ 5V)

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