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磁珠法提纯mRNA

2014-12-08  点击:[]

实验概要

真核细胞的mRAN是单顺反子,其最显著的特征是具有5'端帽子结构和3'端的poly A的结构,此poly A结构为mRNA的提取提供了有效的途径,人们利用碱基配对原理,采用寡聚T结构作为亲和柱材料,当含mRNA的总RNA样品流经寡聚T柱时,mRAN即被特异性的结合到柱上,从而可与其它RNA相分开,这就是寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲和柱分离mRAN的原理。目前虽然mRNA的提取已有多种方法,如超速离心法、免疫法,但较常用的、简便的方法还应是柱层析法。不过近几年,mRNA的提取方法又有所改进和突破,mRNA的磁珠分离即是这些新方法中的一类主要技术。该技术建立于3类强有力的相互作用上,即A与T碱基间的强配对性;链菌素抗生物素与生物素间的强免疫作用及稀土元素磁铁与顺磁性物质间的强磁性作用。mRNA的磁珠分离技术提取mRNA的原理主要为用生物素标记的Oligo(dT)与mRNA3'端的poly A退火形成杂交体,然后用带有亲和素(链菌素抗生物素)的顺磁磁珠洗涤并捕获杂交体,形成杂交体-磁珠复合体,最后用磁架将此复合体捕获,这样mRNA即可与其它形式的RNA相分开,进一步用无RNase无菌水洗涤,即可获得纯化的mRNA。

实验原理

主要试剂

mRNA 分离系统试剂盒,异丙醇,3MNaAC

主要设备

水浴,离心机,取液器,分光光度计

实验步骤

1. 生物素标记的Oligo(dT)探针与mRNA的煺火

1) 在DEPC处理过的1.5mlEppendof管中,加入0.2-1mg的总RNA和无RNase的水至终体积为0.5ml。

2) 65℃加热10min.

3) 加入2μl生物素标记的Oligo(dT)探针和12μl的20×SSC于RNA中轻轻混匀,室温放置,逐渐冷却平衡至室温,此步操作一般需10min。

2. 亲和素顺磁磁珠(SA-PMPS)的冲洗

1) 将SA-PMPS轻晃开后,放入磁性分离架中,使SA-PMPS集中于试管一则(约30秒),小心去除上清(不用离心方法)用1.5ml0.5×SSC漂洗SA-PMPS,用磁性分离架集中磁珠,去除上清,漂洗3次。

2) 将漂洗过的SA-PMPS重新悬浮于0.2ml0.5×SSC中。

3. 杂交体的生成及漂洗

1) 将上步"3"中褪火的生物素标记的Oligo(dT)探针,全部加到上步"5"管中,轻轻混匀,室温放置10min。每隔2分钟轻轻混匀一次。

2) 用磁性分离架捕获磁珠,吸弃上清。

3) 用0.3ml0.1×SSC漂洗SA-PMPS,用磁性分离架集中磁珠,吸弃上清,漂洗4次。

3. 洗涤收集mRNA

1) 将漂洗过的SA-PMPS重新悬浮于0.2mlDEPC水中。

2)用磁性分离架捕获磁珠,将洗脱的水相吸至一新管中。重复洗涤一次,吸取水相,两次水相合并(约0.25ml)。

3) 在洗脱液中加入0.1体积的NaAC,1体积的异丙醇,-20℃沉淀过夜,12000g 离心10min,75%乙醇洗沉淀,真空干燥。

4) 提取mRNA质量的分光光度计检测,将所提mRAN分别在260,280nm比色,要求A:OD260%/ OD280%不小于2.0及40μg所提样品在OD260%的值为1 。

5) 提取mRNA质量的电泳检测,在1%的变性胶上,EB染色后,mRNA应在0.5-8Kb间均匀着色,1.5-2Kb间着色较强。

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