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流式细胞仪的使用程序

2022-06-02  点击:[]

一.开机程序

1.检查稳压器电源,打开电源,稳定5分钟.

2.打开储液箱,倒掉废液,并在废液桶中加入400ml漂白水原液.打开压力阀,取出鞘液桶,将鞘液桶加至4/5满(一般可用三蒸水,做分选必须用PBS或FACSFlow),合上压力阀.确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置.

3.将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY,预热5~10分钟.排出过滤器内的气泡.

4.如果需要打印,打开打印机电源.

5.打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志.

6.执行仪器PRIME功能一次,以排除Flowcell中的气泡.

7.分析样品时,先用FACAFlow或PBS进行HIGHRUN约2分钟.

做过分选后,每次开机后需冲洗管道:向分选装置上装上两个50ml离心管,不接通浓缩系统,摁下右下角白色按钮开始冲洗.待自动停止后接通浓缩装置,同上法冲洗一次. 二.预设获取模式文件(AcquisitionTemplateFiles

1.从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗,可利用此视窗编辑一个获取模式文件.

2.选取屏幕左列绘图工具中的Dotplot,绘出一个或多个DotPlots(点图).从DotPlot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源,并确定适当的x轴和y轴参数.

3.选取屏幕左列绘图工具中的Histogram,同上法可绘出Histogram(直方图).

4.将此视窗命名后储存于FACStationG3 BDApplications CELLQuest FolderEXP文件夹中,下次进行相同实验时可直接调用.

本计算机中已设定两个模式文件:ACQ和EXP,储存于FACStationG3 BDApplications CELLQuestEXP文件夹中,ACQ用于细胞DNA检测,EXP用于细胞表面标志分析. 三.用CELLQuest进行仪器的设定和调整

1.从苹果画面中选取CELLQuest,进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件.

2.从屏幕上方Acquire指令栏中,选取ConnecttoCytometer(快捷键:+B)进行电脑和仪器的连机.将出现的AcquisitonControl对话框移至合适位置.

3.从Cytometer指令栏中,开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四个对话框,并将它们移至屏幕右方,以便获取数据时随时调整获取条件.也可以用+1,2,3,4获得此四个对话框.

4.在Detectors/Amps对话框中,先为每个参数选择适当的倍增模式(amplifiermode):线性模式Lin或对数模式Log.一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时,FSC和SSC多以线性模式Lin测量,且DDMParam选择FL2,而FL1,FL2与FL3则以对数模式Log测量;分析细胞DNA含量时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3皆以Lin进行测量,且DDMParam选择FL2;分析血小板表型时,FSC,SSC,FL1,FL2,FL3等均以Log进行测量.

5.放上待检测的样品,将流式细胞仪设定于RUN,流速可在HIGH或LOW上.

6.在AcquisitonControl对话框中,选取Acquire,开始获取细胞.在以下的仪器调整过程中随时选取Pause,Restart以观察调整效果.未完全调整好之前不要去掉SETUP前的“3”.

7.在Detectors/Amps对话框中,调整FSC和SSC探测器中的信号倍增度:PMTvoltages(粗调)与AmpGains(细调),使样品信号出现在FSC-SSC点图内,且三群细胞合理分布.

8.在Threshold对话框中选择适当的参数设定Threshold,并调整Threshold的高低,以减少噪音信号(细胞碎片).一般做细胞表型时用FSC-H而做DNA时用FL2-H.Threshold并不影响检测器对信号的获取,但可改善画面质量.

9.从屏幕左列绘图工具中选取Region(区域),并在靶细胞周围设定区域线,即通常所说的门.圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易.

10.在Detectors/Amps对话框中,调整荧光检测器(FL1,FL2,FL3,FL4等)的倍增程度.根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群,使之分布在正确的区域内.

11.在Compensation对话框中,根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色(或多色)荧光染色所需的荧光补偿.比如应该为FL1+FL2-的细胞群却分布在FL1+FL2+区域内,则需调大FL2-?%FL1中的“?”,并从FL1-FL2点图中观察新的调整是否恰当.

12.在Status对话框中可见:LaserPower:正常值-Run/Ready为14.7mW,Standby为5mW;Lasercurrent:正常值为6Amps左右.

13.调整好的仪器设定可在InstrumentSettings对话框中储存,下次进行相同实验时可调出使用,届时只需微调即可.

本计算机中已有三个名叫储存于FACStationG3 BDApplications CELLQuest FolderIMM- InstrSettings及FACStationG3 BDFiles Instrument Settings Files CalibFile和Mast-Cell-Set的参数文件,前二者可用于分析人白细胞,后者用于分析小鼠肥大细胞. 四.通过预设的获取模式文件进行样品分析

1.从苹果标志中选择CELLQUEST,新视窗出现后从File指令栏中选择Open,打开预设的获取模式文件.

2.从屏幕上方Acquire指令栏中,选取ConnecttoCytometer进行电脑和仪器的连机.将出现的AcquisitonControl对话框移至合适位置.

3.从Cytometer指令栏中选取InstrumentSettings,在其对话框中选择Open以调出以前存储的相同实验的仪器设定,按Set确定.

4.在Acquire指令栏中,选择Acquisition&Storage决定储存的细胞数,参数,信号道数.其中Resolution在做细胞表面标志时选择256,做DNA时选择1024.ParameterSaved…则根据不同的检测对象选择不同的参数.

5.在Acquire指令栏中,选择ParameterDescription,以决定文件存储位置(folder),文件名称(file),样品代号以及各种参数的标记(panel),即安排tube1,2,3…的检测参数.一般本仪器获取的数据按照检测对象的不同分别储存于FACStationG3BDApplicationsCELLQuestIMM和DNA文件夹中.文件根据日期命名.

6.在Cytometer指令栏中,选择Counters,将此对话框移至合适位置,以便于随时观察events计数.

7.将样品试管放至检测区,在AcquireControl对话框中选取Acquire以启动样品分析测定.

8.微调仪器设定,待细胞群分布合适后选择AcquireControl对话框中Pause,Abort,去除Setup前的“3”,开始正式获取信号,存储数据.

9.当一定数目的细胞被测定后,获取会自动停止,并会自动存储数据.重复步骤7,继续分析下一个样品,直到所有的样品数据分析完毕.

当所有样品分析分析完毕,即换上三蒸水,并将流式细胞仪置于“STANDBY”状态,以保护激光管. 五.关机程序

1.从File中选择Quit,退出软件,选择Don't Save至苹果屏幕.

2.用4ml1:10稀释的漂白水作样品,将样品置于旁位(vacuumison),以外管吸去约2ml,在将样品架置于中位(vacuumisoff),再HIGHRUN5分钟(内管吸去2ml).

3.改用三蒸水4ml作样品,同上处理.

4.按Prime三次.

5.此时仪器自动转为STANDBY状态,换2ml三蒸水.必须在仪器处于“STANDBY”状态10分钟后再依次关掉计算机、打印机、主机、稳压电源,以延长激光管寿命,并确保应用软件的正常运行.

6.填写使用登记表.

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