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荧光染色观察药物诱导细胞凋亡

2022-06-02  点击:[]

【原理】

Hoechst 33258为特异性DNA染料,与A-T键结合,这种染料对死细胞或经70%冷乙醇固定的细胞可立即染色。而活细胞的着色是渐进性的,在10min内可达饱和。在荧光显微镜下,活细胞核呈弥散均匀荧光,出现细胞凋亡时,细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。

【试剂与器材】

1. Hoechst 33258贮存液: 称取Hoechst 33258试剂1mg,用20ml蒸馏水溶解后,滤过,4℃ 避光保存。用时蒸馏水10倍稀释成染色液。

2.封片液(pH5.5):20mmol/L柠檬酸;50mmol/L磷酸氢二钠;50%甘油, 长春新碱

3.细胞固定液 甲醇、冰乙醇(3∶1),现配。

【操作步骤】

1.将细胞以4 .0×10 8 /L密度接种于用12孔培养板中,每孔3 mL,37℃ 、5%CO 2孵箱中培养 至细胞贴壁,加入长春新碱,使之终浓度分别为0、10、100μg /mL。继续培养过夜。细胞学涂片或细胞甩片机制备的单细胞片

2.细胞固定液4℃ 固定5min

3.蒸馏水清洗后,点加Hoechst 33258染色液,10min

4.蒸馏水洗片后,用滤纸沾去多余液体

5.封片剂封片后将荧光显微镜下观察并拍照。

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