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细胞器分离和细胞脱核技术

2015-06-09  点击:[]

一、破碎细胞的方法

1.杆状玻璃匀浆器法

•该匀浆器由一根端部表面磨砂的玻璃杆和一个内壁磨砂的玻璃套管组成。使用时,先用锋利的刀片把组织块切碎,然后把碎块加入套管中,用力使玻杆移动使组织细胞破碎。

2.高速组织捣碎机法

•使用时将4℃预冷的组织碎块或细胞悬液加入捣碎机的梅花玻璃杯中,至杯体积的1/3即可盖好玻璃杯盖,固定好带杆叶片刀,缓慢调整旋转速度,一般开机数十秒后,组织细胞即可被高速旋转的叶片刀破碎。但不宜时间过长,以防高速旋转产生热而导致分离物中的活性物降解,用冷却水降温更好。

3.超声波处理法

•超声波发生器能产生高强度的超声信号,经换能器传送至与之接触的溶液中,由声波形成冲击和振动而产生剪力,致使细胞破碎,动物组织肝、肾、胸腺、淋巴结、腹水细胞、红细胞、体外培养的细胞均可在短时间内破碎,因超声时可产热,应注意冰浴冷却,生物大分子如核酸和酶对超声敏感,一般不宜采用

4.化学裂介法

•在细胞悬液中加入Triton-100、NP-40、SDS,去氧胆酸钠均可使细胞裂解,往往仍需机械去辅助,方可在短时间内使细胞完全裂解,裂解后应清除化学裂解剂,以防止干扰分析。

5.反复冻融法

•组织细胞浓液在-70℃或液氢中冷冻后,于37℃融化,经3~4次冻融周期,可使细胞破碎。

二、部分细胞器的分离方法

一般采用差速离心或密度梯度离心的方法得到分离细胞器。

1.细胞膜的分离

•细胞膜又称质膜,分离细胞膜有助于研究生物膜的结构与功能。一般说,红细胞膜与线粒体膜的制备用差速离心法即可,其他细胞膜的分离可根据膜组分的密度大小不同,采用梯度离心后,分布于指定区域,可分离得到纯制品

2.线粒体的分离

•线粒体普遍存在于真核细胞中,它是细胞呼吸的主要场所,细胞活动所需能量主要依靠在线粒体内进行氧化所产生的能,线粒体的分离主要靠差速分离。

3.线粒体膜分离

•线粒体膜分离方法主要是密度梯度离心

4.聚核糖体的分离

•核糖体是由核糖酸和蛋白质组成的核糖核酸蛋白颗粒,附着在粗面内质网的称固着核糖体,分散在细胞内的称游离核糖体,数个或数十个核蛋白体聚在一起称为聚核糖体,一般用差速离心法可分离出聚核糖体。

5.微粒体分离

•微粒体是一种脂蛋白所包围的囊泡,含核糖核酸,蛋白质和脂类,分离微粒体的方法是利用分级离心法,去掉细胞核和线粒体后,经超速离心而制备。

细胞核的分离和细胞脱核技术

细胞核作为一个功能单位,完整地保存遗传物质,并指导RNA合成,进而表达出相应的蛋白,在一定程度上细胞核控制着细胞的代谢、生长、分化和繁殖活动。因此细胞核的分离是研究基因表达及细胞核形态结构的首要步骤。不同组织来源的细胞经匀浆后,可用分级离心等方法将细胞核进行分离纯化。

一、细胞核的分离

•用溶液A粗提离心取沉淀B液中除蛋白,然后于C液中进行蔗糖密度梯度高速离心,沉淀用A液离心洗涤一次可收取。

•(1)溶液A:0.25mol/L蔗糖

•10mmol/L Tris-HCL pH8.0

•3mmol/L MgCL2

•0.1mmol/L苯甲基磺酰氟化物(PMSF为蛋白酶抑制剂,用乙醇现配)

•(2)溶液B:含0.1%(v/v)Triton×-100的溶液A。

•(3)溶液C:2.2mol/L蔗糖

•10mmol/L Tris-HCL pH8.0

•3mmol/L MgCL2

•0.1mmol/L PMSF

操作步骤

•(1)大鼠在实验前禁食24h,断头处死,剖腹切取30g肝细胞用0.9%NaCL充分洗去血污,剪碎肝组织,然后按溶液A8mL/g肝脏组织加溶液A。

•(2)取适量肝细胞悬液,移入带聚四氟乙稀头的玻璃匀浆器中,手工匀浆片刻。

•(3)将匀浆液分成6管,以2000g离心10分钟。

•(4)弃上清液,把粗提的细胞核悬浮于240mL溶液中,并通过4层纱布滤除粗渣。

•(5)溶液分6管,以2000g离心10分钟,弃上清。

(6)沉淀物悬浮于240ml溶液B中,以2000g离心10分钟。

•(7)弃上清,沉淀物悬浮于190ml溶液C中,取6支超速离心管,每管加5mL溶液C,然后把细胞核悬液铺在溶液C上层,以25000r/min离心60分钟。

•(8)弃去上清,用溶液A轻轻荡洗管壁及沉淀物表面两次,将离心管倒置,用滤纸擦干管口。

•(9)向离心管底部滴加几滴溶液A,用玻璃棒轻轻搅匀,然后补加30mL溶液A。

•(10)以2000g离心20分钟,弃上清液,沉淀物为纯化的肝细胞核。

二、细胞脱核技术

•细胞经松胞菌素B(Cytochalasin B;CB)以10mg/L浸没,以12000r/min离心15~20分钟,可使99%的细胞发生脱核,形成无核细胞质体(Cytoplast)和无胞质的核质体(Nucleoplast)

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