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诱发肿瘤动物模型的建立

2014-02-24  点击:[]

原理:诱发性肿瘤动物模型是指研究者用化学致癌剂、放射线、致癌病毒诱发动物的肿瘤等。

实验材料:肿瘤细胞、小鼠

试剂:无血清培养基质、3%中性甲醇、石腊等

仪器耗材:低温离心机、血球计数器、游标卡尺等

实验步骤

一、肝癌

1.二乙基亚硝胺(DEN)诱发大白鼠肝癌

(1)取体重250 g左右的封闭群大白鼠,雌雄不拘;

(2)按性别分笼饲养。除给普通食物外,饲以致癌物,即用 0.25%DEN水溶液灌胃,剂量为10 mg/kg,每周一次,其余5天用0.025%DEN水溶液放入水瓶中,任其自由饮用;

(3)共约4个月可诱发成肝癌;

(4)也可以单用0.005%掺入饮水中口吸服8个月诱发肝癌。

2.4-2甲基氨基氮苯(DBA)诱发大鼠肝癌

(1)用含0.06%DBA的饲料喂养大鼠,饲料中维生素B2 不应超过1.5~2 mg/kg;

(2)4~6月就有大量的肝癌诱发成功。

3.2-乙酰氨基酸(2AAF)诱发小鼠、狗、猫、鸡、兔肝癌

(1)给成年大鼠含0.03% 2AAF标准饲料;

(2)每日每平均2~3 mg 2AAF(也可将2AAF混于油中灌喂),3~4月后有80~90%动物产生肝肿瘤。

4.二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌:

(1)用剂量为每日0.3~14 mg/kg体重,混于饲料或饮水中给予;

(2)6~9个月后255/300大鼠发生了肝癌。

5.亚胺基偶氮甲苯(OAAT)诱发小鼠肝癌

(1)用1%OAAF苯溶液(约0.1 ml含1 mg)涂在动物的两肩胛间皮肤上,隔日一次,每次2~3滴,一般涂100次。

(2)实验后7~8周即而出现第一个肝肿瘤,7个月以上可诱发小鼠肝肿瘤约55%。

(3)或用2.5 mg OAAT溶于葵瓜子油中,给C3H小鼠皮下注射4次,每日间隔10天,也可诱发成肝癌。

6.黄曲霉素诱发大鼠肝癌

(1)每日饲料中含0.001~0.015 ppm,混入饲料中喂6个月后,肝癌诱发率达80%。

二、胃癌

1.甲基胆蒽诱发小鼠胃癌

(1)取20 g左右的小鼠,无菌手术下,在腺胃粘膜面穿挂含甲基胆蒽(MC)线结。

(2)含MC的线结是用普通细线,在一端打结后,将线结置于盛有MC小玻璃试管内,在酒精灯上微微加温,使MC液化渗入线结。MC浓度为0.05~0.1 g 20-甲基胆蒽内浸入10~20根线。

(3)手术埋线后4~8个月可诱发成功胃癌。

2.不对称亚硝胺诱发小鼠胃癌

剂量为0.25 ml/kg体重,3个月后全部动物发生前胃乳头状癌,7~8个月后有85~100%发生前胃癌。昆明种最敏感。A系次之,615系小鼠敏感性最差。

3.甲基亚硝基醋酸尿素诱发小鼠胃癌

给BD大鼠饮水中加甲基亚硝基醋酸尿素,剂量为2 mg/kg体重,每周饮用5次,520天后全部大鼠均发生了腺胃癌。

三、食管癌

1.甲基苄基亚硝胺(MBNA)诱发大鼠食管癌

(1)取体重100 g以上的Wistar大鼠;

(2)任其食用含甲基苄基亚硝胺的饮水,并将MBNA掺入饲料中使每日摄入量达0.75~1.5 mg/kg体重;

(3)80~100天可诱发成食管癌。

2.二烃黄樟素(Dihydrosafrole)诱发大鼠食管癌

(1)二烃黄樟素是一种制备啤酒的调味品,在大鼠饲料中加入百万分之二千五百至一万(2500~10000 ppm)黄樟素,就能引起20~75%的食管癌。

3.甲基苄基亚硝胺诱发大鼠食管癌

(1)用0.2%或0.005% 的甲基苄基亚硝胺水溶液,给动物经口灌喂,每天一次,大鼠灌注剂量为1 mg/kg体重;

(2)至第27天即发现一例食管乳头状瘤,154天发现第一例食管癌, 11个月食管癌的发生率为53%。

四、肺癌

1.二乙基亚硝胺(DEN)诱发小鼠肺癌

(1)小白鼠每周皮下注射1%DEN水溶液一次,每次剂量56 mg/kg,DEN总剂量达到868 mg;

(2)观察时间为100天左右时,发癌率可达40%。

(3)DEN总剂量达到1176 mg,观察时间为半年左右时;发癌率可达94%。

2.乌拉坦诱发肺腺癌

(1)小鼠(A系, 1~11/2月龄)较大鼠敏感,每次每只腹腔注入10%乌拉坦生理盐水液0.1~0.3 ml,间隔3~5日再注,共注2~3个月,每只小鼠用量约为 100 mg;

(2)注后3个月肺腺癌发生率为100%,而且多数为多发性,这种诱发瘤为良性。

3.苯并芘诱发肺腺癌

(1)猴气管内注入3,4-苯并芘(苯并花为3~15 mg与等量之Fe2O3混合液),每周一次,共10次;

(2)6只猴中有2只诱发肺的鳞状上皮癌。

4.硫酸铵气溶胶诱发肺腺癌

(1)用硫酸胺气溶剂给100只大鼠吸入;

(2)13个月后所有大鼠都发生了肺腺癌。

5.甲基胆蒽诱发肺腺癌

(1)用0.2%明胶作悬浮剂将甲基胆蒽混合后给金地鼠气管内注入,每次0.1 ml(含甲基胆蒽 5 mg)每周一次,共6次;

(2)53周后有62.5%动物发生了肺癌。

五、鼻咽癌

1.二甲基胆蒽(MC)诱发大鼠鼻咽癌

(1)取直径2~3 mm的硬质塑米管,在酒精灯上小火拉成锥形,每段长约3.5 cm,管内填以结晶体MC。

(2)小管一端用火封闭,以防药物外溢,尖端用针刺数孔,使MC能从小妃溢出。

(3)取体重120 g左右的大白鼠,雌雄均可,乙醚麻醉后,由前鼻孔将上述含MC的塑料小管插入鼻腔,利用前鼻孔较小管粗端为小的特点,稍加用力,迫使小管全部进入鼻腔内,其尖部可达鼻咽腔。不需另加固定,即可使小管长期留于鼻腔内。

(4)待到预定时间(半年以上),或动物自行死亡时,到其鼻咽部,10%福尔马林固定,脱钙后,石蜡包埋,进行连续切片。发癌率可达60%以上。

2.二乙基亚硝胺滴鼻法诱发鼻咽癌

(1)取120 g左右大白鼠,雌雄均可,乙醚麻醉后,用磨平针尖的8号针头,从前鼻孔轻轻插入,针尖可达鼻咽腔;

(2)经注射器灌注用1%吐温-80新配的 33.3%DEN混悬液0.0 2 ml(含DEN 6.7 mg)每周1次,共15~20次,可诱发成鼻咽癌。

六、宫颈癌

1.二甲基胆蒽(MC)诱发宫颈

取雌性小白鼠,以附有0.1 mgMC的棉纱线结在动物不麻醉的状态下,借助于阴道扩张器及磨纯的弯针,将线穿入宫颈。经右宫角背部穿出,使线结固定于宫颈口。线的另一端则固定于背部肌肉,缝合皮肤,挂线以后,同日开始连续注射青霉素2~3天。以防术后感染。至一定时间(半年左右)处死动物,宫颈组织用10%福尔马林固定,石蜡包埋,连续切片。

七、结肠癌

1.二甲基苄肼(Dimethlhydrazine,DMH)诱发鼻咽癌

(1)给四周龄的雄性大白鼠,皮下注射二甲基苄肼(Dimethlhydrazine,DMH)每周一次,连续21周,每次 DMH21 mg/kg;

(2)最后一次给药后1~4周,处死动物;

(3)降结肠部位用Bouin液固定,脱水,石蜡包埋,切片。所用之DMH先配成每100 ml含 400 mg的母液,并加EDTA37 mg,用氢氧化纳(0.1 N)液将pH调至6.5备用。

注意事项

1.要设计不同的实验组和对照组, 每组动物数一般为 5-10 只;

2.一般接种肿瘤6-8 周后,小鼠的肿瘤可生长至直径为 15-20mm ( 即小鼠会濒临死亡) 时, 可眼球取血,分离血清并保存血清, 处死小鼠, 取肿瘤组织照相, 取部分肿瘤组织作 冰冻组织切片( 或- 80℃ 保存), 作相应的免疫组织化学染色 , 取部分肿瘤组织用3%中性的甲醛固定, 石腊包埋, 作常规HE 染色。

其他说明

1.芳香胺及偶氮染料类致癌物的特点

(1)通常需要长期、大量给药才能致癌;

(2)肿瘤多发生于远隔作用部位的器官如膀胱、肝等;

(3)有明显的种属差异;

(4)其本身不是直接致癌物,致癌是由于其某种代谢产物的作用;

(5)其致癌作用往往受营养或激素的影响,例如,奶黄仅在以缺少蛋白质和核黄素的饲料喂饲大鼠时才引起肝癌,而且雄性大鼠较敏感,邻位氨基偶氮甲苯则易起雌性大鼠的肝癌。

2.亚硝胺类的致癌特点

(1)致癌性强,小剂量一次给药即可致癌;

(2)对多种动物(包括猴、豚鼠等不易诱发肿瘤的动物)的许多器官(包括食管、脑、鼻窦等不易引起癌的器官)能致癌,甚至可以通过胎盘致癌,如给怀孕大鼠以二乙基亚硝胺(Diethy lnitrosamine,DEN)可比较快地引起仔鼠的神经胶质细胞瘤;

(3)具有不同结构的亚硝胺有明显的器官亲和性,例如二甲基亚硝胺等对称的衍生物常引起肝癌,不对称的亚硝胺如甲基苄基亚硝胺常诱发食管癌;在大鼠,二丁基亚硝胺能引起膀胱癌,二戊基亚硝胺能诱发肺癌,而N-甲基-N-硝基-N-1-亚硝基胍则能引起胃肠癌。

3.黄曲霉毒素的致癌特点

(1)黄曲霉毒素的毒性很强,很小剂量(1mg/kg体重)即可使狗、幼龄大鼠、火鸡或小鸭致死;

(2)其致癌性也极强,最小致癌剂量比亚硝胺还要小数十倍,是已知化学致癌物中作用最强者;

(3)它能诱发多种动物(从鱼到猴)的肝癌,也可引起肾、胃及结肠的腺癌,滴入气管内可引起肺鳞状细胞癌;

(4)注入皮下可引起局部的肉瘤,还有报告认为,它可引起泪腺、乳腺、卵巢等其它部位的肿瘤。

4.其他

在动物实验中早已确定:乙硫氨酸可诱发大鼠肝癌;乌拉坦(氨基甲酸乙酯,C2H5O-CONH2)、氨乙胺可引起小鼠的肺癌;一些卤代烃如四氯化碳、氯仿等可引起大鼠或小鼠的肝癌。

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