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免疫组织化学操作规程

2012-06-12  点击:[]

一、编号:JS0606

二、标题:免疫组织化学操作规程

三、关键词:免疫组织化学 操作规程

四、目的:免疫组织化学主要进行蛋白物质(抗原)的定性、定位检测。

五、背景知识

20世纪30年代,随着生物化学的发展和电子显微镜技术的应用,组织化学迎来了复兴时代。自从E. Takamatsu(高松英雄)和G. Gomori 1939年同时证明了硷性磷酸酶的组织化学方法,以后的30年间,酶组织化学得到了飞速发展,高松证明了磷酰胺酶、ATP酶;Gomori设计了酸性磷酸酶、脂酶、酯酶等组织化学证明法。

此间,金属盐法,硫化钴法,偶氮色素法,偶氮色素四唑盐法(tetrazolium salts method)以及磷酸化酶组织化学证明法等相继问世。特别是H. Scheldon和D. Brandes等人把电镜与酶组织化学结合起来,以金属沉淀法观察了酸性磷酸酶和硷性磷酸酶,奠定了电镜酶组织化学(electron microscope enzyme histochemistry)基础。后来A. M. Seligman(1967)提出锇黑化法(Osmification method)进一步阐述了电镜组织化学的基本原理和反应过程。

1950年A. H. Coons等人提出了荧光抗体法,从而把免疫学引入组织化学实验中,后来P. K. Nakane,S. Avrameas和L. A. Sternberger等人以辣根过氧化物酶为标记物对酶进行观察,创立了酶标抗体法,从而为组织化学开辟了新途径。

随着分子生物学的发展,1969年人们把分子杂交技术应用到组织切片和细胞标本上,开始探索原位杂交技术,经过30年不断应用、完善和发展,特别是探针制备与标记物两大关键技术的突破,目前原位杂交技术已广泛应用于遗传学、病毒学、神经内分泌学、病理学、免疫学和发育生物学等各个领域,显示出巨大的应用潜力。

现代组织化学已经渗透和应用于生命科学的许多学科,经过近几十年的发展,产生了许多分支,如核酸与核蛋白、蛋白质与氨基酸、脂类与脂蛋白、碳水化合物与粘蛋白及粘多糖、无机物组织化学、酶组织化学电镜组织化学、荧光组织化学、免疫组织化学、同工酶组织化学、定量组织化学、原位杂交组织化学和放射自显影技术等。总之,现代组织化学的概念已经远远超过了原有范围,无论从理论、内容、技术手段、研究范围都比过去更广泛、更深入。

六、原理:基于利用放射性核素和其他标记物(荧光素、酶、重金属离子等)作为示踪剂,通过免疫亲和(抗原-抗体特异性结合)和核酸杂交(碱基配对特异性连接)途径,在组织切片或细胞涂片上,原位显示生物大分子的动态变化的一门染色技术。

七、仪器设备和材料

1、仪器设备

18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉,水浴锅。

2、试剂

1)PBS缓冲液(pH7.2~7.4):NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO44.3mmol/L,KH2PO41.4mmol/L。

2)0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(CB,pH6.0,1000ml):柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。

3)0.5mol/L EDTA缓冲液(pH8.0):700ml水中溶解186.1gEDTA•2H2O,用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。

4)1mol/L的TBS缓冲液(pH8.0):在800ml水中溶解121gTris碱,用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。

5)酶消化液: ①0.1%胰蛋白酶液:用0.1%CaCl2(pH7.8)配制。②0.4%胃蛋白酶液:用0.1N的HCl配制。

6)3%甲醇-H2O2溶液:用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

7)封裱剂:①甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.0~9.5)等量混合;②甘油和TBS(或PBS)配制。

8)TBS/PBS pH9.0~9.5,适用于荧光显微镜标本;pH7.0~7.4适合于光学显微镜标本。

八、操作步骤

1、脱蜡和水化

脱蜡前,应将组织切片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

1)组织切片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后再浸泡10分钟;

2)无水乙醇中浸泡5分钟;

3)95%乙醇中浸泡5分钟;

4)70%乙醇中浸泡5分钟。

2、抗原修复

用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片。

1)抗原热修复

⑴高压热修复:在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)。盖上不锈钢高压锅的盖子,但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上,缓慢加压,使玻片在缓冲液中浸泡5分钟,然后将盖子锁定,小阀门将会升起来。10分钟后,去除热源,置入凉水中,当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。

⑵煮沸热修复:电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至95℃左右,放入组织切片加热10~15分钟。

⑶微波热修复:在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至沸腾后将组织切片放入,断电,间隔5~10分钟,反复1-2次。适用的抗原有:AR,Bax,Bcl-2,C-fos,X-jun,C-kit,C-myc,E-cadherin,Chromogranin A,Cyclin,ER,Heat shock protein,HPV,Ki-67,MDMZ,p53,p34,p16,p15,P-glycoprotein,PKC,PR,PCNA,ras,Rb,TopoismeraseⅡ等。

2)酶消化方法:常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶。胰蛋白酶使用前预热至37℃,切片也预热至37℃,消化时间约为5~30分钟;胃蛋白酶37℃消化时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原,常用于Collagen,Complement,Cytokeratin,C-erB-2,GFAP,LCA,LN等抗原。

3、免疫组织化学染色完整步骤

SP法

1)脱蜡、水化;

2)PBS洗2~3次各5分钟;

3)3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上,室温静置10分钟;

4)PBS洗2~3次各5分钟;

5)抗原修复;

6)PBS洗2~3次各5分钟;

7)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟后甩去多余液体。

8)滴加I抗50μl,室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。

9)4℃过夜后需在37℃复温45分钟。

10)PBS洗3次各5分钟;

11)滴加II抗40~50μl,室温静置,或37℃1小时;

12)II抗中可加入0.05%的tween-20。

13)PBS洗3次各5分钟;

14)DAB显色5~10分钟,在显微镜下掌握染色程度;

15)PBS或自来水冲洗10分钟;

16)苏木精复染2分钟,盐酸酒精分化;

17)自来水冲洗10~15分钟;

18)脱水、透明、封片、镜检。

SABC法

1)脱蜡、水化。

2)PBS洗两次各5分钟。

3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2,室温封闭5~10分钟,蒸馏水洗3次。

4)抗原修复。

5)PBS洗5分钟。

6)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟后甩去多余液体。

7)滴加I抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时(4℃过夜后在37℃复温45分钟)。

8)PBS洗3次每次2分钟。

9)滴加生物素化二抗,20~37℃20分钟。

10)PBC洗3次每次2分钟。

11)滴加试剂SABC,20℃~37℃20分钟。

12)PBS洗4次每次5分钟。

13)DAB显色:DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度)。

14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。

15)脱水、透明、封片、镜检。

九、注意事项

1、为达到免疫组织化学技术的要求,组织固定越新鲜越好。

2、组织脱水必须彻底干净。

3、切片必须完整、均匀、平展、无皱折。

4、切片的附贴必须牢固,必须使用合适的粘贴剂。新的载玻片,放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜,然后取出,经自来水彻底冲洗后,浸入酒精中达2小时以上,取出擦干备用或烘干也可。然后再将载玻片浸入3-氨基-三乙氧基-硅烷(3-Aminopropyl triethoxy- silane)的稀释液(1:50用丙酮或无水乙醇稀释都可以)中硅化10分钟,后经无水乙醇洗2次,烘干即可使用。

5、切片必须烘烤附贴牢固,既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片,又不至于破坏抗原,切片在60℃的恒温干燥箱中烘烤2-5小时最为合适。

6、切片脱蜡必须干净,否则将会影响免疫组化染色的最后结果。

7、必须彻底抑制内源性过氧化物酶的活性,才能降低背景的染色。H2O2甲醇较适合于大多数的情况,因为除了H2O2外,甲醇对各种酶,都有钝化的作用,因此H2O2甲醇的双重作用效果较好。

8、抗体的加入须注意的问题:①当PBS冲洗完毕后,在加入抗体,如一抗,二抗或三抗。必须将存留于切片上的多余的PBS摔干,但不能让切片干涸,切片干涸,往往可产生非特异性染色,切片上PBS存留过多,将会稀释加入的抗体,影响加入抗体的浓度,同时也将影响最后的结果,如假阴性等。②加入的抗体以一滴为佳。当擦干组织块周边多余的PBS后,切片保持着一定的湿润度,此时加入另外的抗体为最佳时候,滴入抗体以一滴50μl为好,加入后,轻微地摇匀地覆盖于切片上,使最后的结果稳定均衡,不至于有的地方有反应,有的地方无反应。③切片没擦好将会影响加入抗体的质量。当加入抗体后,它可缩于切片的一边,此时你为了使加入的抗体能够完全地覆盖整个切片,便会使劲地加入抗体,此时的结果是,抗体依然滑向一边,或者完全露出,这不光没达到目的,还浪费抗体,正确的做法就是彻底地用PBS冲洗,摔干切片擦干切片周边的PBS,再滴入一滴抗体轻轻摇匀即可。

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