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单细胞悬液制备操作规程

2022-06-02  点击:[]

一、编号:JS0602

二、标题:单细胞悬液制备操作规程

三、关键词:单细胞悬液 操作规程 流式细胞术

四、目的:规范单细胞悬液制备的操作

五、背景知识:单细胞悬液的制备是流式细胞术的前期准备工作之一。

六、原理:实体组织制备单细胞悬液可用酶消化、机械法。

七、材料:0.25%胰酶,0.01mol/L PBS,300目尼龙网,0.04%EDTA液,红细胞裂解液(氯化铵4.16g,碳酸氢钾0.5g,EDTA·2Na0.02g,溶于500ml蒸馏水)。

八、操作步骤

(一)实体组织单细胞悬液的制备

1、酶消化法

⑴选取的组织立即放入预冷的组织培养液或PBS中,清洗血迹及其它污染物。去除组织块中的块死成分、纤维、脂肪及血管(专门制备相关细胞时除外)。

⑵ 用眼科剪将组织块剪成1mm3左右小块,放在预冷的组织培养液或PBS中并进行漂洗,洗去剪碎的细胞碎片。

⑶ 加入适量酶消化液,37℃恒温水浴消化20~30min,期间进行间断振荡或吹打细胞。

⑷ 用冷培养液或PBS终止消化,用300目尼龙网过滤除去组织团块,收集滤过的细胞,500g离心10min后去上清,并用PBS洗1~2次。细胞计数总数不少于106个细胞。

⑸ 如果下一步做DNA含量分析,则将细胞悬液用70%预冷乙醇4℃固定。如果做免疫荧光测定,则不用乙醇固定,须尽快染色后上机检测。

2、机械法(网搓法)

⑴ 前处理同酶消化法⑴、⑵步。

⑵ 将300目尼龙网扎在小烧杯上,将剪碎的组织放在网上,以眼科镊或刮刀轻搓组织块,边搓边以PBS冲洗,直至将组织搓完。

⑶ 收集细胞悬液,500g离心10min后去上清,并用PBS洗1~2次。细胞计数总数不少于106个细胞。

⑷ 同酶消化法⑸步。

(二)血液白细胞悬液的制备

取肝素抗凝全血100μl,加红细胞裂解液3ml,振荡混匀后静置10min,500g离心10min,去上清,再加红细胞裂解液3ml,混匀后500g离心100min,去上清,加PBS洗2遍后备用。

九、注意事项

1、除酶需要保持一定温度获得最好消化效果外,其它操作时液体需在4℃冰箱中预冷以减少对细胞的损伤。

2、不同组织制备单细胞悬液需参考文献选用相对应的分离方法,部分组织制备单细胞悬液需采用其它方法(如肝细胞、软骨细胞等)。

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