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5700型荧光定量PCR仪操作规程

2022-06-02  点击:[]

一、编号:YQ0701

二、标题:5700型荧光定量PCR仪操作规程

三、关键词:PCR 荧光定量 操作规程

四、目的:规范5700型PCR仪操作程序

五、背景知识:ABI公司5700PCR仪由热循环仪、高压汞灯、计算机和定量PCR软件组成。使用96孔样品基座,可同时扩增96个0.2ml的PCR反应管或一个96孔PCR反应板内的样品。温度控制范围:4-99.9摄氏度;最大循环次数为99次。适用于分析某一基因的拷贝数和转录水平,对特异病原体DNA和RNA进行定量研究。

六、原理:荧光定量PCR(FQ-PCR)的工作原理是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性,在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交,探针的5’端标以荧光发射基因FAM(6-羧基荧光素,荧光发射峰值在518nm处),靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基若丹明,荧光发射峰值在582nm处),探针的3’开端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。当探针保持完整时,淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离,抑制作用被解除,518nm处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板DNA发生杂交,延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动,当移动到探针切断,淬灭作用被解除,荧光信号释放出来。模板每复制一次,就有一个探针被切断,伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系,因此用该技术可对模板进行准确定量。反应结束后,通过电脑分析,可直接给出定量结果,由于荧光探针的引入,显著提高了实验的特异性。

七、材料和仪器:5700型PCR仪、RT反应产物

八、操作步骤

1、依次打开总电源,稳压器电源。打开windows NT工作站。

2、同时按下Ctrl+Alt+Delete等录,弹出登录信息对话框。

3、键入下列信息:

User name:PCR

Password:5700

单击OK,等待计算机完成启动动作。

4、打开9600热循环仪和GeneAmp 5700核酸序列检测器电源。

5、双击电脑桌面上的GeneAmp 5700 SDS图标,或从开始菜单选择GeneAmp 5700 SDS。在出现新的样品板(New Plate Application)窗口选中5700和5700 Quantiation,单击OK。

6、在出现的样品板窗口,单击样品类型下拉菜单,为每个样品孔选择正确的样品类型。选中所以要指定引物/探针的已命名的样品孔,点击工具栏内的P按钮,弹出引物/探针调色板,为特定的样品孔选择引物/探针。

7、选中所以想指定已知DNA起始拷贝数的标准品样品孔,单击工具栏的Q按钮,弹出定量对话框,对于每一个所列出的引物/探针,单击对应的定量区域,输入已知的起始拷贝数,单击OK。在样品板窗口,单击仪器页面,设置好热循环参数。

8、除去96孔反应板的光学支持基座,将96孔反应板安放到9600热循环仪的加热块上,将GeneAmp 5700序列检测器滑到样品池上方,顺时针旋转检测器顶部的大旋钮,压紧盖子。

9、从File菜单,选择Save选项,保存好样品板文档。单击仪器窗口的Run按钮,进行PCR热循环。

10、PCR热循环完成后,单击结果页面,单击Preferences按钮,在弹出的对话框中设置基线和阀值。

11、在分析菜单下执行Analyze,软件分析完成。

12、选中想要数据后进行打印。

13、关闭9600热循环仪和GeneAmp 5700核酸序列检测器电源,关闭计算机。

14、依次关闭稳压器电源,总电源。

九、注意事项

1、反应循环数一般应在35个以上,45个以下,太少易出现假阴性,太多则背景干扰信号太多。

2、引物设计应尽量避免出现二聚体和发夹结构,最好每次都利用熔解曲线进行考察。

3、需要尽量减少模板的反复冻溶。

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